Nörosfer Hücrelerinin Doğal Kromatin İmmünopresipitasyonu

Özet

Kaynak: Mendez, F. M. et al., Murin Beyin Tümörü Nörosferleri Kullanılarak Doğal Kromatin İmmünopresipitasyonu. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, doğal kromatin immünopresipitasyonu kullanılarak bir fare beyin tümöründen türetilen nörosfer hücrelerinden protein-DNA komplekslerinin izolasyonunu göstermektedir. Aşağı akış analizi için DNA'yı serbest bırakmak için kromatin hazırlama, immünopresipitasyon, yıkama ve protein sindirimi adımlarını detaylandırır.

Protokol

1. Doğal kromatin immünopresipitasyonu (ChIP)

1. Kromatin hazırlama
   1. {{}} Türetilmiş nörosfer hücrelerinin (NS) stokunu yaptıktan sonra, NS'yi bir T-75 şişesinde 15 mL NSC ortamında 37 °C'de %95 hava ve %5 CO₂ atmosferine sahip bir doku kültürü inkübatöründe kültürleyin. Bir birleşik T-75 plakası 3-5 X 10⁶ hücre verecektir.
   2. Hücreler birleştiğinde, NS'yi 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı boşaltın ve 1 mL hücre ayrışma ortamı ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de 5 dakika inkübe edin. 5 mL ortam ekleyin ve bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın.
      NOT: İmmünopresipitasyon (IP) reaksiyonu başına 1 x 10⁶ hücre gereklidir. Bir pre-immün serum veya IgG kontrolünün de dahil edilmesi gerektiğini unutmayın.
   3. NS'yi 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde 300 x g'da 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı boşaltın ve NS peletini 1 mL dengeli tuz çözeltisi ile yeniden süspanse edin ve süspansiyonu düşük protein bağlayıcı 1.5 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın.
   4. NS'yi 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin, süpernatanı boşaltın ve hücre peletini 95 μL sindirim tamponunda (50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 mM CaCl₂, %0.2 polietilen glikol oktilfenil eter) 1 x 10⁶ hücre başına yüksek konsantrasyonda (1:100) proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenmiştir. Topaklanmayı önlemek ve herhangi bir kabarcık oluşturmasını önlemek için hücreleri hemen yukarı ve aşağı pipetleyin.
   5. Mikrokokal nükleazı (MNaz) %50 gliserol içinde yeniden süspanse ederek 1 mg/mL çözelti (1.15 birim / μL, -20 ° C'de saklanır) yapmak için "1x" stok olarak adlandırılacaktır. %50 gliserol ( örneğin., 900 μL "1x" MNaz ve 100 μL %50 gliserol) ile ikinci bir 1:9 seyreltme yaparak "0,1x" stok yapın ve -20 °C'de saklayın.
   6. 5 μL "0.1x" MNaz ve 145 μL sindirim tamponunu karıştırın. Enzimi her zaman buz üzerinde tutun. 1 x 10⁶ hücre başına sindirim tamponuna 5 μL seyreltilmiş MNaz ekleyin. Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun ve tüpü tam olarak 12 dakika boyunca 37 °C bloğa yerleştirin. 12 dakikalık doğru bir inkübasyon süresi sağlamak için numuneleri birer birer işleyin.
   7. 1 x 10⁶ hücre başına 10 μL 10x MNaz Durdurma Tamponu (110 mM Tris-HCl, pH 8.0, 55 mM Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)) ekleyin. Numuneler bu noktadan itibaren buz üzerinde tutulmalıdır.
   8. 110 μL "2x Radyoimmünopresipitasyon Test tamponu (RIPA) tamponu" (280 mM NaCl,% 1.8 polietilen glikol oktilfenil eter,% 0.2 sodyum dodesil sülfat (SDS),% 0.2 Na-deoksikolat, 5 mM etilen glikol-bis (β-aminoetil eter) -N, N, N', N'-tetraasetik asit (EGTA; 4 ° C'de saklanır) 1 x 10⁶ hücre başına yüksek konsantrasyonda (1:100) proteaz inhibitör kokteyli ile desteklenir. Karıştırmak için tüpü hafifçe vurun.
   9. Tüpleri 4 ° C ve 1700 x g'da bir mikrofüje içinde 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir normal 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın (düşük protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpleri artık gerekli değildir) ve buz üzerinde saklayın. Peleti atın.
      
2. Immunopresipitasyon (IP)
   1. Protein A ve Protein G manyetik boncuklarını 1:1 oranında karıştırın. Her IP için 25 μL boncuk hazırlayın.
   2. 1 mL RIPA tamponu (10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA, 140 mM NaCl, %1 polietilen glikol oktilfenil eter, %0.1 SDS, %0.1 Na-deoksikolat; 4 °C'de saklanır) ekleyerek boncukları yıkayın, düşük konsantrasyonda (1:1000) proteaz inhibitörleri ile desteklenmiştir.
   3. Boncukların yıkama solüsyonundan ayrılmasını sağlamak için bir mıknatıs kullanın ve yıkama solüsyonunu boşaltın (yaklaşık 1 dakika). Yıkama adımını iki kez gerçekleştirin.
   4. Proteaz inhibitörleri (1:1000) ile desteklenmiş RIPA tamponu kullanarak boncukları orijinal hacmine yeniden süspanse edin.
   5. Gerekirse, kromatini, proteaz inhibitörleri (1:1000) ile desteklenmiş RIPA tamponu kullanarak seyreltin, böylece her IP 100-200 μL'lik bir hacme sahip olur. Giriş için IP kromatin başına kullanılan hacmin %10'unu ayırın.
      NOT: Örneğin, IP başına 200 μL kullanılıyorsa, giriş için 20 μL seyreltilmiş kromatin ayrılmalıdır. Toplam dört IP için, toplam kromatin hacmi 820 μL'ye seyreltilmelidir.
   6. Girişi hazırlayın. Girişe proteinaz K (0,5 mg/mL) takviye edilmiş 100 μL TE tamponu (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 mM EDTA) ekleyin ve girişi 55 °C'de 1 saat inkübe edin.
   7. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) saflaştırma kiti kullanarak girişi saflaştırın ve kitte sağlanan 50 μL elüsyon tamponunda elüte edin.
   8. Bir mikrohacim spektrofotometresi kullanarak girişin konsantrasyonunu ölçün ve sonuçları bir not defterine kaydedin. Kitten elüsyon tamponu ile boş.
      NOT: Fare nörosferlerinde, her IP için yaklaşık 6 μg DNA kullandık.
   9. Girişi %1'lik bir jel üzerinde çalıştırın veya standart ayarları kullanarak bir DNA Biyoanalizörüne 1 μL yükleyin. Kalanını aşağı akış uygulamalarında giriş olarak kullanmak üzere saklayın.
   10. Her IP için 10 μL yıkanmış protein A ve G manyetik boncuk ekleyin ve IP'yi 4 °C'de 1 saat inkübe edin.
       NOT: Örneğin, üç IP için 30 μL protein A ve G manyetik boncuk ekleyin.
   11. Numuneleri bir mıknatısın üzerine yerleştirin ve boncukların ayrılmasına izin verin. Önceden belirlenen miktarı yeni bir 1.5 mL tüpe aktararak kromatini bölün.
   12. Antikoru ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için kapakları plastik parafin filmle sarın. Numuneleri gece boyunca 4 °C'de 20 rpm'de dönerek inkübe edin.
       NOT: Konsantrasyon, üretici tavsiyelerine göre ampirik olarak belirlenmelidir.
   13. Ertesi gün, tüpleri oda sıcaklığında, 2000 x g'da 10 saniye boyunca bir mini santrifüj kullanarak döndürün. Ardından, her IP'ye 10 μL boncuk ekleyin ve IP'yi 20 rpm'de dönüşle 4 ° C'de 3 saat inkübe edin.
       
3. IP Yıkamaları ve Protein Sindirimi
   1. {{}} Her IP'ye düşük konsantrasyonda (1:1000) proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş 150 μL RIPA tamponu ekleyin ve IP'yi 4 °C'de 20 rpm'de 5 dakika döndürerek inkübe edin. Numuneyi manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncukların ayrılmasına izin verin. Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın. Bu adımı beş kez tekrarlayın.
   2. 150 μL lityum klorür (LiCl) tamponu (250 mM LiCl, 10 mM Tris pH 8.0, 1 mM EDTA,% 0.5 NP-40,% 0.5 Na-deoksikolat; 4 ° C'de saklayın) düşük konsantrasyonda (1:1000) proteaz inhibitörleri ile desteklenmiş her IP'ye ekleyin ve IP'yi 4 ° C'de inkübe edin ve 5 dakika boyunca 20 rpm'de döndürün. Numuneyi manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncukların ayrılmasına izin verin. Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın.
   3. 150 μL soğuk Tris-EDTA (TE) (proteaz inhibitörü yok) ekleyin ve numuneyi 5 dakika boyunca 20 rpm'de döndürerek 4 ° C'de inkübe edin. Numuneyi manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncukların ayrılmasına izin verin. Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın.
   4. Son yıkama adımından sonra, numuneyi proteinaz K (0.5 mg / mL) ile takviye edilmiş 100 μL TE tamponu içinde yeniden süspanse edin ve numuneyi 55 ° C'de 1 saat inkübe edin.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent	G2946-90004	bioanalyzer
AccuSpin Micro 17R, soğutulmuş	Fisher Scientific	13-100-676
C57BL/6	Taconic	B6-f	C57BL/6 mouse
Calcium Chloride	Aldrich	22350-6	buffer reagent
D-Luciferin, Potasyum Tuzu	Goldbio	LuckK-1g
DiaMag1.5 magnetic rack	Diagenode	B04000003	manyetik boncuk yıkamaları için
DiaMag Rotator EU	Diagenode	B05000001	rotator
DMEM/F-12	Gibco	11330-057	NSC component
Dynabeads Protein A	Thermo Fisher Scientific	10001D	protein A manyetik boncuklar
Dynabeads Protein G	Thermo Fisher Scientific	10003D	protein G manyetik boncuklar
EGF	PeproTech	AF-100-15	%0,1 BSA ve aliquot'ta 20 μg/mL stok hazırlayın.
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)	Sigma	E-4884	buffer reagent
Etilen glikol-bis(β-aminoetil eter)-N,N,N',N'-tetraasetik asit) (EGTA)	Sigma	E-4378	buffer reagent
Fetal Boval Serum	Gibco	10437028	hücreleri dondurmak için
FGF	PeproTech	100-18b	%0,1 BSA ve aliquot'ta 20 μg/mL stok hazırlayın.
Forceps	Güzel Bilim Araçları	11008-13	tümör diseksiyonu için
Gliserol, MB Grade	EMD- Millipore<
HBSS	Gibco	14175-103	balanced salt solution
Fluriso	VETone	501017	inhalasyon anestezisi
Ivis Spectrum	Perkin-Elmer	124262	in vivo optik görüntüleme sistemi
Hyqtase	HyClon	SV3003001	hücre ayırma ortamı
Lithium Chloride	Sigma	L8895	buffer reagent
Düşük bağlayıcı mikrotüpler	Corning Costar	CLS3207	low protein bağlayıcı mikrosantrifüj tüpü
Microcentrifuge tube	Fisher	21-402-903	regular microcentrifuge tube
Micrococcal Nuclease	Thermo Fisher Scientific, Affymetrix	70196Y	Her parti farklı olabilir; Deneyler ve alikot için yeterli miktarda satın alın.
N2	Gibco	17502-048	NSC component
Normocin	Invivogen	NOL-36-063	anti-mikrobiyal ajan, 0.1 mg/mL'de kullanın.
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	18896-50ML	buffer reagent
Kimble Kontes Pellet Pestle	Fisher Scientific	K749515-0000
Proteaz İnhibitörü Cocktail	sigma-aldrich	P8340	aliquot ve -20 °C'de saklayın.
Protinase K	sigma-aldrich	P2308	suda 10 mg/mL stok yapın; alikot ve -20 °C'de saklayın.
QIAquick PCR Saflaştırma Kiti	Qiagen	28104	DNA saflaştırma kiti
Scalpel	Güzel Bilim Araçları	10007-16	tümör diseksiyonu için
Sodyum Klorür	VWR	0241-5KG	buffer reagent
Sodium Deoxycholate	Sigma-Aldrich	D670-25G	buffer reagent
Sodyum Dodesil sülfat (SDS)	Sigma	L-4390	buffer reagent
Tris Base	Thermo Fisher Scientific	Bp152-1	buffer reagent
Triton X-100<	BP 151-500	polietilen glikol octylphenyl ether
Standart Mini Santrifüj	Fisherbrand	12-006-901	Standart Mini Santrifüj<
SZX16 mikroskop	Olympus	SZX16	floresan diseksiyon mikroskobu
Nanodrop One	Thermo-Fisher Scientific	ND-ONEC-W

td style='border-bottom:1px katı #000000;border-right:1px katı #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>356352td style='border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Thermo Fisher Scientifictr style='height:19px;'>