Fare Beyin Bölümlerinde Gen Ekspresyonunu Tespit Etmek için Çift Floresan In Situ Hibridizasyon Yapılması

Özet

Kaynak: Jolly, S., et.al. Fare Beyin Bölümlerinde Üç Genin Ekspresyonunun Tespiti için Çift Floresan In Situ Hibridizasyonunun İmmünoetiketleme ile Birleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, fare beyni bölümlerindeki iki RNA hedefinin ekspresyonunu görselleştirmek için çift floresan in situ hibridizasyonun kullanımını göstermektedir. Protokol, floresein, izotiyosiyanat ve digoksijenenin ile etiketlenmiş problar kullanılarak RNA'nın sıralı tespitini ve ardından duyarlılığı artırmak için enzimatik sinyal amplifikasyonunu içerir. Elde edilen floresan, doku içindeki hedef RNA'ların birlikte lokalizasyon analizini sağlar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Hibridizasyon

1. 65 °C yıkama tamponu hazırlayın: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x salin sodyum sitrat), %50 (h/h) formamid ve %0.1 (h/h) Tween-20.
2. MABT tamponu hazırlayın: 100 mM maleik asit, 150....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	65°C yıkama tamponu
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146<
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Isıyla etkisiz hale getirilmiş koyun serumu	Sigma	S2263
Hydrofobic pen<	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-konjuge antikor	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjuged<	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
Montaj medium	Dako	S3023
Leica SP2 konfokal mikroskop	Leica
.22 μM filter	Millex	SLGP033RS
Deiyonize formamid	Sigma	F9037	ISH engelleme arabelleği için
Sodium chloride	Sigma	S3014
Hydrochloric acid	VWR International	20252.29<
Sodium phosphate monobasic ansuus	Sigma	S8282
Sodyum fosfat dibazik dihidrat	Sigma	30435
Maya tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt'ın çözümü	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Sodyum asetat	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503

içintd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:122pt;'> td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:135pt;'>Cosmo Biotd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:135pt;'>Rochetd style='border-left-style:none;border-top-style:none;'>