Fare Beyin Bölümlerinde Gen Ekspresyonunu Tespit Etmek için Çift Floresan In Situ Hibridizasyon Yapılması

Özet

Kaynak: Jolly, S., et.al. Fare Beyin Bölümlerinde Üç Genin Ekspresyonunun Tespiti için Çift Floresan In Situ Hibridizasyonunun İmmünoetiketleme ile Birleştirilmesi. J. Vis. Uzm. (2016).

Bu video, fare beyni bölümlerindeki iki RNA hedefinin ekspresyonunu görselleştirmek için çift floresan in situ hibridizasyonun kullanımını göstermektedir. Protokol, floresein, izotiyosiyanat ve digoksijenenin ile etiketlenmiş problar kullanılarak RNA'nın sıralı tespitini ve ardından duyarlılığı artırmak için enzimatik sinyal amplifikasyonunu içerir. Elde edilen floresan, doku içindeki hedef RNA'ların birlikte lokalizasyon analizini sağlar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Hibridizasyon

1. 65 °C yıkama tamponu hazırlayın: 150 mM NaCl, 15 mM Na₃C₃H₅O(COO)₃ (= 1x salin sodyum sitrat), %50 (h/h) formamid ve %0.1 (h/h) Tween-20.
2. MABT tamponu hazırlayın: 100 mM maleik asit, 150 mM NaCl, %0.1 (h/h) Tween-20, pH 7.5.
3. İki probu (DIG etiketli ve FITC etiketli) 1/1.000 hibridizasyon tamponunda (% 50 (h / h) deiyonize formamid ile DEPC ile muamele edilmiş deiyonize su, 200 mM NaCl, 5 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 5 mM NaH₂PO₄, 5 mM Na₂HPO₄, 0.01 mg / ml maya tRNA, 1× Denhardt çözeltisi ve% 10 w / v dekstran sülfat) 65 ° C'ye önceden ısıtılmış ve iyice karıştırın.
4. Her slayta yaklaşık 300 μl hibridizasyon karışımı uygulayın, fırında pişmiş (200 °C) lamellerle lamel yapın ve O/N'yi nemlendirilmiş bir odada 65 °C'de inkübe edin.
5. Slaytları önceden ısıtılmış yıkama tamponu içeren bir Coplin kavanozuna aktarın. Slaytları yıkama tamponu ile 65 ° C'de iki kez 30 dakika yıkayın.
6. RT'de MABT ile slaytları üç kez 10 dakika boyunca yıkayın.

2. FITC Probe'un

1. görselleştirilmesiISH bloke edici tampon hazırlayın: %2 bloke edici reaktif ve %10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş koyun serumu içeren MABT.
2. İsteğe bağlı: Gerekli antikor solüsyonlarının hacmini azaltmak için slayttaki doku bölümlerinin etrafına daireler çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın.
3. Slaytları nemlendirilmiş bir odada ISH engelleme tamponu ile RT'de 1 saat inkübe edin.
4. Slaytları O/N'de 4 °C'de 1/500 (v/v) oranında seyreltilmiş yaban turpu peroksidaz (POD) - konjuge anti-FITC antikoru ile inkübe edin.
5. Slaytları %0,1 (h/v) Tween-20 (PBST) içeren PBS içeren bir Coplin kavanozuna yerleştirin. PBST'de 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın ve her seferinde yeni PBST ile değiştirin.
6. Kullanmadan hemen önce, Amplifikasyon seyrelticisine 100 kez seyrelterek floresan tiramidi hazırlayın. Bu örnek için FITC-tyramide kullanın.
7. Bunu slaytlara ekleyin ve RT'de 10 dakika bekletin.
8. Slaytları bir Coplin kavanozuna yerleştirin ve 10 dakika boyunca PBST'de 3 kez yıkayın.

3. DIG Probe'un görselleştirilmesi<

1. span style='background-color:transparent;color:#1a202c;'>0.1 m tris- HCl pH 8.2 hazırlayın.
2. Slaytları RT'de 1 saat boyunca ISH engelleme arabelleği ile inkübe edin.
3. Slaytları O/N'de 4 °C'de ISH bloke edici tamponda 1/1.500 (v/v) ile seyreltilmiş bir alkalin fosfataz (AP) konjuge anti-DIG antikoru ile inkübe edin.
4. MABT ile üç kez 10 dakika yıkayın.
5. RT'de 5 dakika boyunca 0.1 M Tris-HCl pH 8.2 ile iki kez yıkayın.
6. Kullanmadan hemen önce, tabletleri 0.1 M Tris pH 8.2'de çözerek Fast Red solüsyonunu hazırlayın. Çözeltiyi 0.22 μM'lik bir filtreden süzün.
7. Slaytları 37 °C'de Fast Red solüsyonu ile nemlendirilmiş bir odada inkübe edin. Optimum gelişme süresi değiştikçe, çökelti oluşumunu izlemek için slaytları düzenli olarak bir floresan mikroskobu ile kontrol edin. Bu örnek için, reaksiyonu 2-3 saat sonra durdurun.
8. PBST ile üç kez 10 dakika yıkayın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Superfrost plus slides	Thermo Scientific	J1800AMNZ
Sodium citrate	Sigma	S4641	65°C yıkama tamponu
Formamide	Sigma-Aldrich	F7503
Tween-20	Sigma-Aldrich	P1379
Coverslips	VWR International	631-0146<
Coplin Jar	Smith Scientific Ltd	2959
Blocking reagent	Roche	11096176001
Isıyla etkisiz hale getirilmiş koyun serumu	Sigma	S2263
Hydrofobic pen<	DAI-PAP-S	09:20
α-FITC POD-konjuge antikor	Roche	11426346910
TSA™ Plus Fluorescein System	Perkin Elmer	NEL741001KT	26:00:00
α-DIG AP-conjuged<	11093274910
Fast red tablets	Roche	11496549001
Montaj medium	Dako	S3023
Leica SP2 konfokal mikroskop	Leica
.22 μM filter	Millex	SLGP033RS
Deiyonize formamid	Sigma	F9037	ISH engelleme arabelleği için
Sodium chloride	Sigma	S3014
Hydrochloric acid	VWR International	20252.29<
Sodium phosphate monobasic ansuus	Sigma	S8282
Sodyum fosfat dibazik dihidrat	Sigma	30435
Maya tRNA	Roche	10109495001
50x Denhardt'ın çözümü	Life Technologies	750018
Dextran sulfate	Sigma	D8906
Sodyum asetat	Sigma	S2889
Trizma Base	Sigma	T1503

içintd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:122pt;'> td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:135pt;'>Cosmo Biotd style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:135pt;'>Rochetd style='border-left-style:none;border-top-style:none;'>