Jel Gömülü Hasta Kaynaklı Hastalıklı Fibrovasküler Dokunun İmmünofloresan Boyanması

Özet

Kaynak: Gucciardo, E., et. al., Proliferatif Diyabetik Retinopatide Fibrovasküler Komplikasyonlar için Ex Vivo Doku Kültürü Modeli. (2019)

Bu video, fibrin jel içine gömülü fibrovasküler dokunun ex vivo kültürleri için bir immün boyama protokolünü detaylandırmaktadır. Bu, proliferatif diyabetik retinopati ile ilişkili vasküler değişikliklerin ayrıntılı olarak görselleştirilmesini sağlar

Protokol

Numune toplamayı içeren tüm prosedürler enstitünün IRB yönergelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Full-Mount Immunofluorescence Staining

NOT: Bu protokol 5 gün sürer ve belirtildiği yerlerde gece boyunca inkübasyonlarla kesintiye uğrayabilir. Fibrin jellerinin hiçbir noktada kurumasına izin vermeyin. Aksi belirtilmedikçe tüm adımlar RT'de gerçekleştirilir.

1. Boyama protokolünü başlatmadan önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın.
   1. Fiksasyon sonrası solüsyon: eşit miktarda aseton ve metanol (örn. 50 mL) karıştırarak 50:50 aseton:metanol solüsyonu hazırlayın. -20 °C'de saklayın. Bu solüsyonu en geç boyamadan bir gün önce hazırlayın. Bu çözelti -20 °C'de tekrar saklanabilir ve sonraki boyamalar için kullanılabilir.
      NOT: Aseton ve metanol yanıcı ve sağlığa zararlı olduğundan bu çözeltiyi çeker ocakta hazırlayın.
   2. Engelleme solüsyonu: önce PBS'ye %15 FBS ekleyerek PBS'de %15 fetal sığır serumu (FBS), %0.3 oktil fenol etoksilat çözeltisi hazırlayın. Oktil fenol etoksilat ekleyin ve çözünmesi için karıştırın. 4 °C'de saklayın.
      NOT: Bu çözelti önceden büyük miktarlarda hazırlanabilir, -20 °C'de 15 mL alikotlarda saklanabilir ve boyama protokolünün başladığı gün kullanımdan önce çözülebilir. Her boyama protokolü için taze hazırlanmış veya taze çözülmüş alikotlar kullanın.
   3. Yıkama solüsyonu: 995,5 mL PBS'ye 4,5 mL oktil fenol etoksilat ekleyerek %0,45 oktil fenol etoksilat ile takviye edilmiş 1 L PBS hazırlayın. Çözünmesi için karıştırın. RT'de saklayın.
2. Paslanmaz çelik kare kenarlı bir spatula kullanarak damlacıkları plakadan dikkatlice kaldırın. Merkezi kaldırmadan önce damlacığı kenarlardan ayırın ve 1 mL PBS içeren 12 oyuklu bir plakaya aktarın.
   NOT: Bu plaka formatında sabitleme sonrası, yıkama ve engelleme adımlarını gerçekleştirin.
3. Damlacıkları 1 mL buz gibi 50:50 aseton:metanol çözeltisi ile ~1 dakika sonra düzeltin (damlacıkların kenarlığı beyaza dönecektir).
   NOT: Aseton ve metanol sağlığa zararlı olduğundan bu adımı çeker ocakta gerçekleştirin.
4. 2 mL PBS'de 3 - 5 yıkama ile durulayın (rehidrasyon tamamlandığında damlacıklar PBS solüsyonunda batar).
   NOT: Damlacıklara pipet ucuyla dokunmaktan kaçının, çünkü sabitleme sonrası plastiğe yapışırlar. Protokol boyunca, damlacıklara zarar verebileceği veya tamamen yok edebileceği için, sabitleme sonrası, antikor, bloke etme ve yıkama solüsyonlarını emme yoluyla aspire etmekten kaçının. Bunun yerine, plakayı eğin ve 500-5.000 μL'lik bir pipet kullanarak çözeltileri dikkatlice çıkarın.
5. Kalıntıları temizlemek için engelleme solüsyonunu 21.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
   NOT: Çözelti, santrifüjleme için 1,5 mL'lik tüplerde ayrı ayrı kullanılabilir. Kullanılmayan çözelti 4 °C'de saklanabilir ve sonraki tüm ilgili adımlar için kullanılabilir.
6. Damlacıkları RT'de 2 saat boyunca 500 μL engelleme solüsyonunda inkübe edin.
   NOT: Kullanılan blokaj solüsyonunun hacmini azaltmak için, plaka bir destek üzerinde eğilebilir ve en az 300 μL solüsyon/damlacık kullanılabilir.
7. Primer antikor karışımını (en az 30 μL/damlacık) bloke edici çözelti içinde uygun seyreltmede hazırlayın ve 21.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
8. Damlacıkları yuvarlak kenarlı bir spatula kullanarak yuvarlak (U) tabanlı 96 oyuklu plakaya aktarın ve gece boyunca 4 °C'de en az 30 μL/damla birincil antikor karışımı ile inkübe edin.
9. Ertesi gün, damlacıkları 2 mL yıkama solüsyonu/kuyusu içeren 12 oyuklu bir plakaya aktarın, önce üç adet 5 dakikalık yıkama ve ardından dokuz adet 30 dakikalık yıkama ile durulayın. Son yıkamayı (2 mL) gece boyunca 4 °C'de bırakın.
10. Ertesi gün, PBS ile üç kez durulayın ve damlacıkları yuvarlak (U) tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın.
11. Yıkamalar sırasında, uygun florofor konjuge ikincil antikor karışımını (1:500 seyreltilmiş, en az 30 μL/damlacık) bloke edici solüsyonda hazırlayın ve 21.000 x g ve 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin.
12. Damlacıkları yuvarlak kenarlı bir spatula kullanarak yuvarlak (U) tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve en az 30 μL ikincil antikor karışımı ile RT'de 4 saat boyunca ışıktan korunarak inkübe edin.
    NOT: Sonraki tüm inkübasyonları ve yıkama adımlarını ışıktan korunarak gerçekleştirin.
13. Damlacıkları yuvarlak kenarlı bir spatula kullanarak 2 mL yıkama solüsyonu/kuyusu içeren 12 oyuklu bir plakaya aktarın, önce üç adet 5 dakikalık yıkama ve ardından dört adet 30 dakikalık yıkama ile durulayın. Son yıkamayı (2 mL) gece boyunca 4 °C'de bırakın.
14. Ertesi gün, jelleri beş kez 30 dakikalık yıkama ile ve ardından üç kez PBS ile durulayın. Son yıkamayı (2 mL) gece boyunca 4 °C'de bırakın.
15. Ertesi gün, yuvarlak kenarlı bir spatula kullanarak damlacıkları yuvarlak (U) tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın ve RT'de 30 dakika boyunca 10 μg/mL Hoechst nükleer boyası (en az 30 μL/damlacık) ile inkübe ederek çekirdekleri karşı boyayın.
    NOT: Çekirdek karşı boyama için 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile desteklenmiş montaj ortamı alternatif olarak kullanılabilir. Bu durumda, bu adım ve adım 1.16 atlanır ve doğrudan adım 1.17'ye geçilir.
16. Damlacıkları yuvarlak kenarlı bir spatula kullanarak 2 mL PBS/kuyucuk içeren 12 oyuklu bir plakaya aktarın ve PBS ile üç kez durulayın.
17. Damlacıkları mikroskop lamına aşağıdaki gibi monte edin:
    1. Kare şeklinde 22 mm x 22 mm kapak camının kenarlarına dar bir tabaka hızla sertleşen montaj ortamı uygulayın ve ~1 dakika kurumaya bırakın. Montaj ortamının aşırı sertleşmesini önlemek için bu adımı her damla için ayrı ayrı gerçekleştirin.
       NOT: Çabuk sertleşen montaj ortamı sağlığa zararlı olduğundan bu adımı çeker ocakta gerçekleştirin.
    2. 2 mL deiyonize su içeren 12 oyuklu bir plakanın kuyusuna daldırarak damlacığı durulayın ve yuvarlak kenarlı bir spatula kullanarak bir mikroskop lamına aktarın. Küçük bir parça emici kağıt kullanarak fazla suyu alın.
    3. Damlacık üzerine 15 μL sertleşmeyen antifade montaj ortamı dağıtın.
       NOT: Alternatif olarak, Hoechst nükleer boyası kullanılmamışsa, 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren montaj ortamı kullanılabilir.
    4. Kapak camını, hızlı sertleşen montaj ortamı mikroskobik slayta bakacak şekilde damlacığın üzerine nazikçe yerleştirin ve oturmasına izin verin.
       NOT: Hızlı sertleşen ortam mikroskobik slayta yapışacak ve damlacığı yerinde tutacaktır.
18. Tüm damlacıklar için adım 1.17'yi tekrarlayın. Her mikroskop slaytına iki damlacık monte edin.
19. Slaytları RT'de ~2 saat kurumaya bırakın ve gece boyunca 4 °C'de saklayın. Slaytların yatay olarak yerleştirildiğinden ve ışıktan korunduğundan emin olun.
20. Konfokal mikroskop veya optik kesit fonksiyonu ve 20x veya 40x objektif ile donatılmış dik epifloresan mikroskobu kullanarak lekeli doğal veya uç nokta FT ex vivo kültürlerini görüntüleyin. Aynı anda dokunun daha büyük bir alanını yakalamak için döşeme işlevini kullanın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Material
Cell culture plates, 96-well, U-bottom	Greiner Bio-One	392-0019	Tam montajlı immünofloresan
Yuvarlak/Düz Spatula, Paslanmaz Çelik	VWR	82027-528<
Lameller 22x22mm #1	Menzel/Fisher	15727582	Used for mounting
Microscope slides	Fisher	Kindler K102	Usedfor mounting
Emici kağıt	VWR	115-0202	Montaj
PBS tablets	Medicago	09-9400-100	1x PBS
Aseton	Sigma-Aldrich	32201-2.5L-M	Sabitleme sonrası çözeltiyi hazırlamak için kullanılır. ZARARLI: koruyucu eldiven ve/veya giysi giyin. Çeker ocakta kullanın.
Methanol	Sigma-Aldrich	32213<
Triton X-100 (oktil fenol etoksilat)	Sigma-Aldrich	T9284	Tam montajlı immünofloresan için kullanılır. ZARARLI: koruyucu eldiven ve/veya giysi giyin.
Hoechst 33342, 20mM	Life Technologies	62249<
VECTASHIELD Antifade Montaj Medium	Vector Laboratories	H-1000	Koruyucu eldiven ve/veya giysi ve göz koruması kullanın. Çeker ocakta kullanın.
VECTASHIELD Antifade Mount Medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200	Çekirdek karşı boyama ile montaj ortamı. Koruyucu eldiven ve/veya giysi ve göz koruması kullanın. Çeker ocakta kullanın.
Eukitt Quick-hardening mount medium	Sigma-Aldrich	03989-100ml	TOXIC: Koruyucu eldiven ve/veya giysi ve göz koruması kullanın. Çeker ocakta kullanın.
Rekombinant insan VEGFA	Ar-Ge Systems	293-VE-010	50 ng/ mL final konsantrasyon
Rekombinant insan VEGFC	Ar-Ge Systems	752-VC-025	200ng/ mL final konsantrasyon
Rekombinant insan TGFβ<	GF346	1 ng/ mL final konsantrasyonu
Rekombinant insan bFGF	Millipore<	50 ng/ mL final konsantrasyonu
CD31 (JC70A)	Dako	M0823	1:100 seyreltmede kullanılır, Donkey anti Mouse Alexa 488 İkincil Ab
CD34 (QBEND10)	Dako	M716501-2	1:100 seyreltmede kullanılır, Donkey anti Mouse Alexa 488 İkincil Ab
CD45 (2B11+PD7/26)	Dako	M070129-2	1:100 seyreltmede kullanılır, Donkey anti Mouse Alexa 488 İkincil Ab
CD68	ImmunoWay	RLM3161	1:100 seyreltmede kullanılır, Donkey anti Mouse Alexa 488 İkincil Ab
Cyard kaspaz-3 (5A1E)	Hücre Sinyali	9664	1:200 seyreltmede kullanılır, Goat anti Rabbit Alexa 594 İkincil Ab
ERG (EP111)<	M731429-2	1:100 seyreltmede kullanılır, Goat anti Rabbit Alexa 594 İkincil Ab
GFAP	Dako	Z0334	1:100 seyreltmede kullanılır, Goat anti Rabbit Alexa 594 İkincil Ab
Ki67	Leica Microsystems	NCL-Ki67p	1:1500 seyreltmede kullanılır, Goat anti Rabbit Alexa 594 Secondary Ab
Lyve1	Ar-Ge Sistemleri	AF2089	1:100 seyreltmede kullanılır, Donkey anti Goat Alexa 568 İkincil Ab
NG2	Millipore	AB5320	1:100 seyreltmede kullanılır, Goat anti Rabbit Alexa 594 İkincil Ab
Prox1	ReliaTech	102-PA32	1:200 seyreltmede kullanılır, Keçi anti Tavşan Alexa 568 İkincil Ab
Prox1	Ar-Ge Systems	AF2727	1:40 seyreltmede kullanılır, Chicken anti Goat Alexa 594 İkincil Ab
VEGFR3 (9D9F9)	Millipore<	1:100 seyreltmede kullanılır, Donkey anti Mouse Alexa 488 İkincil Ab
α-SMA (1A4)	Sigma	C6198	1:400 seyreltmede kullanılır, Cy3 konjuge
Alexa Fluor488 Donkey Anti-Mouse IgG	Life Technologies	A-21202	1:500 seyreltmede
Alexa Fluor594 Keçi Anti-Tavşan IgG	Invitrogen	A-11012	1:500 seyreltmede
Alexa Fluor568 Eşek anti-Keçi IgG	Thermo Scientific	A-11057	1:500 seyreltmede
Alexa Fluor568 Keçi anti-Tavşan IgG	Thermo Scientific	A-11036	1:500 seyreltmede
Alexa Fluor594 Tavuk Anti-Keçi IgG	Molecular Probes	A-21468	1:500 seyreltmede
Name	Company	Comments	Comments
Microscopes
Axiovert 200 ters epifloresan mikroskobu	Zeiss		Taze ve fibrin gömülü FT
AxioImager.Z1 Apotome ile dik epifloresan mikroskobu	Zeiss		Tam montajlı immün boyalı FT'nin görüntülenmesi için

için kullanılırtd style='width:194pt;'>Tam montajlı immünofloresan için kullanılır için kullanılırtd style='width:194pt;'>Sabitleme sonrası çözümü hazırlamak için kullanılır. ZEHİRLİ: koruyucu eldiven ve/veya giysi giyin. Çeker ocakta kullanın.td style='width:194pt;'>Çekirdek karşı boyama için. ZARARLI: koruyucu eldiven ve/veya giysi ve göz ve/veya yüz koruması kullanın.td style='width:174pt;'>Milliporetd style='width:160pt;'>01-106td style='width:174pt;'>Dakotd style='width:160pt;' >MAB3757 kullanılır kullanılır kullanılır kullanılır kullanılır