Floresan In Situ Hibridizasyonun Ardından Fare Beyin Dilimlerinde Nöronların İmmün Boyanması

Kaynak: Baleriola, J., et. al., Yüksek Çözünürlüklü In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Beyin Bölümlerinde Aksonal Lokalize mRNA'ların Tespiti. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, floresan in situ hibridizasyon ve antikor boyama kullanılarak sabit fare hipokampal dilimlerinde kolinerjik aksonlar içinde mRNA'nın tespitini göstermektedir. Floresan mikroskobu, kolinerjik nöronlarda prob etiketli mRNA'ların ve kolin asetiltransferazın mekansal lokalizasyonunu ortaya çıkarır.

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

FISH testi ve ardından ısıya bağlı antijen/RNA maskelemesi kullanılarak immünohistokimya
1. Başlamadan önce gerekli tüm malzemeleri hazırlayın:
  1. {{}} Hibridizasyon fırınını 40 °C'ye ısıtın ve nemlendirilmiş bir ortam oluşturmak için fırına damıtılmış su içeren bir tepsi yerleştirin.
  2. Bir slayt kutusu alın ve nemlendirmek için içine damıtılmış suya batırılmış kağıt havlular yerleştirin. Ardından sürgülü kutuyu hibridizasyon fırınına yerleştirin.
  3. Probları (hem negatif hem de hedef problar) buzdolabından çıkarın ve hibridizasyon fırınında 10 dakika ısıtın. Ardından, probları RT'de soğumaya bırakın.
  4. RT'de AMP 1-4 amplifikasyon reaktiflerini (Floresan Multipleks Reaktif Kitine dahildir).
  5. Antijen alma solüsyonu hazırlayın: 10 mM sodyum sitrat (pH 6),% 0.05 Tween 20. Not: Çözelti süresiz olarak RT'de saklanabilir ve gelecekteki boyama için kullanılabilir.
  6. 50x stok solüsyonunu (Floresan Multipleks Reaktif Kitinde) RNaz içermeyen veya DEPC ile muamele edilmiş suda seyrelterek 1x yıkama tamponu hazırlayın.
    NOT: 1x yıkama tamponu RT'de 1 ay saklanabilir ve gelecekteki boyama için kullanılabilir. 50x yıkama tamponu çökelebilir. Eğer öyleyse, 1x solüsyonu hazırlamadan önce 50x yıkama tamponunu 40 °C'de 10 dakika ısıtın.
2. Slaytları %100 etanolden çıkarın ve RT'de 5 dakika havayla kurutun.
3. 50 ml antijen alma çözeltisi içeren bir coplin kavanozu hazırlayın. Slaytları antijen alma solüsyonuna batırın ve mikrodalga fırında 10 dakika kaynatın.
  NOT: Alternatif olarak, slaytları 100 ml geri alma solüsyonu içeren 100 mm çapında yuvarlak bir cam tabağa yatay olarak yerleştirin.
  1. 1 L'lik bir kabı damıtılmış suyla doldurun ve mikrodalgaya koyun.
    NOT: Maskeleme işlemi gerçekleştirilirken su ısıyı "tamponlayacaktır".
  2. Slaytları mikrodalga fırının içindeki antijen alma solüsyonuna yerleştirin. Slaytları 5 dakika yüksek güçte kaynatın. Numunelerin kaynaması durduktan hemen sonra, ısı 5 dakika daha yüksek güçte tekrar kayar.
  3. RT'de slaytları soğutun.
    NOT: KRİTİK ADIM: kaynatma süresi ve prosedürü, mikrodalga özelliklerine bağlı olarak kullanıcı tarafından belirlenmelidir. Kaynama ne kadar hızlı başlarsa, çözeltinin buharlaşma şansı o kadar yüksek olur. Bu durumda, toplam 10 dakikalık maskeleme süresini tamamlamak için numunelerin daha kısa süreler boyunca iki defadan fazla kaynatılması önerilir. Aksine, ısıtma orta veya düşük güçte yapılırsa, maskeleme 10 dakika boyunca bir kez yapılabilir. Bununla birlikte, numuneler toplamda yaklaşık 10 dakika boyunca sürekli olarak kaynatılmazsa, bu, tespit edilecek hem hedef RNA'nın hem de proteinin kısmen maskelenmesine neden olabilir.
4. Slaytları 1x PBS ile üç kez yıkayın.
5. Arka plan boyamayı değerlendirmek için kullanılan beyin dilimlerine dapB prob setinden 2 - 3 damla (~100 μl) ekleyin. NOT: dapB prob seti bir bakteri genini hedefler ve herhangi bir memeli RNA'sını tanımamalıdır.
6. İlgilenilen RNA'yı tespit etmek için kullanılan beyin dilimlerine 2 - 3 damla hedefleme probu seti ekleyin. NOT: farenin 20 - 1.381 kalıntısını hedefleyen bir prob seti Atf4 mRNA kullanılmıştır.
7. Probun buharlaşmasını önlemek için slaytları parafilm ile örtün, hibridizasyon fırınının içindeki nemlendirilmiş slayt kutusuna yerleştirin ve 40 °C'de 2 saat inkübe edin.
  NOT: İSTEĞE BAĞLI: ek beyin dilimleri, Polr2A faresini hedefleyen bir prob seti ile hibritleştirilebilir ve pozitif kontroller olarak kullanılabilir.
8. Slaytları RT'de 2 dakika boyunca 1x yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
9. Her beyin dilimine 2 - 3 damla amplifikasyon reaktifi AMP 1-FL ekleyin, slaytları parafilm ile kaplayın, slayt kutusuna yerleştirin ve hibridizasyon fırınında 40 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
10. Slaytları RT'de 2 dakika boyunca 1x yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
11. Her beyin dilimine 2-FL 2-FL 2-FL ekleyin, slaytları parafilm ile kaplayın, slayt kutusuna yerleştirin ve hibridizasyon fırınında 40 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
12. Slaytları RT'de 2 dakika boyunca 1x yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
13. Her beyin dilimine 2 - 3 damla amplifikasyon reaktifi AMP 3-FL ekleyin, slaytları parafilm ile kaplayın, slayt kutusuna yerleştirin ve hibridizasyon fırınında 40 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
14. Slaytları RT'de 2 dakika boyunca 1x yıkama tamponu ile iki kez yıkayın.
15. Her beyin dilimine 2 - 3 damla amplifikasyon reaktifi AMP 4-FL ekleyin, slaytları parafilm ile kaplayın, slayt kutusuna yerleştirin ve 40 ° C'de 15 dakika hibridizasyon fırınında inkübe edin.
16. Slaytları RT'de 2 dakika boyunca 1x yıkama tamponu ile iki kez ve 1x PBS ile iki kez yıkayın.
17. Slaytlara 3 mg / ml BSA, 100 mM glisin ve% 0.25 Triton X-100 (pH 7.4) içeren bir blokaj çözeltisinden 100 - 200 μl (veya dilimleri tamamen kaplayacak kadar hacim) ekleyin, üzerlerini parafilm ile örtün ve RT'de 30 dakika inkübe edin.
18. Slaytlara bloke edici solüsyon (1/100) içinde seyreltilmiş 100 - 200 μl anti-ChAT antikoru ekleyin, üzerlerini parafilm ile kaplayın ve 4 °C'de 2 gün inkübe edin. Beyin dilimlerinin kurumamasına dikkat edin. Gerekirse, anti-ChAT antikor solüsyonunu inkübasyondan 24 saat sonra beyin dilimlerine tekrar uygulayın.
19. Slaytları RT'de 5 dakika boyunca 1x PBS'de üç kez yıkayın.
20. 100 - 200 μl uygun Alexa konjuge ikincil antikor ekleyin ( örneğin, ., bu özel örnek için Alexa-594 eşek anti-keçi) slaytlara, parafilm ile örtün ve RT'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
21. Slaytları 1x PBS'de 5 dakika boyunca üç kez yıkayın RT.
22. Slaytları bir kez damıtılmış suyla yıkayın.
23. Kızakları DAPI içeren bir montaj ortamıyla monte edin.
24. Beyin dilimlerini floresan mikroskobu altında görselleştirin.

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Farenin 20-1381 kalıntısı Atf4 mRNA (NM_009716)	Advanced Cell Diagnostics	-	Probe
Human ATF4 mRNA'nın (NM_001675.2<) 15-1256 kalıntılarını hedefleyen özel prob	-	Probe
Negative control probe-DapB	Advanced Cell Diagnostics	310043	Prob
Positive control probe-mouse Polr2A (isteğe bağlı)	Advanced Cell Diagnostics	312471	Probe
Keçi poliklonal anti-ChAT antikoru	Millipore	AB144P
DAPI	Life Technologies	P36935
RNAscope Floresan Multipleks Reaktif Kiti (floresan tespiti için)	Advanced Cell Diagnostics	320850	In situ hibridizasyon kiti

Floresan In Situ Hibridizasyonun Ardından Fare Beyin Dilimlerinde Nöronların İmmün Boyanması

Bu makalede

Özet

Protokol

Malzemeler

Etiketler