Bu video, retinal sinapslarda nörotransmitter reseptör lokalizasyonunu görselleştirmek için bir elektron mikroskobu tekniğini göstermektedir. Retina bölümleri, membrana bağlı nörotransmitter reseptörleri sergileyen ve kolera toksin alt birimi B (CTB) ile işaretlenmiş retinal ganglion hücreleri içerir. İşaretleyiciler altın nanopartikül konjuge antikorlarla işaretlendikten ve kesit ağır metallerle karşı boyandıktan sonra, RGC reseptörleri mikroskop altında görselleştirilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Retinal Sinapslarda Nörotransmitter Reseptörlerinin Yüksek Çözünürlüklü Görüntülenmesi
818 görüntülenme
⸱
28 Nisan 2025
Bu makalede
Özet
Protokol
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Retina Dokusu Fiksasyonu
- Aşağıdaki malzemeleri ve aletleri bir araya getirin: Diseksiyon mikroskobu, çok ince uçlu 2 forseps, makas, selüloz filtre kağıdı, plastik pipet ve mikroskop lamı.
- Sıçanı kapalı bir odada 2.0 ml halotan (uçucu bir anestezik) ile uyuşturun. Bu yöntemlerle yeterli anesteziyi belirleyin: ayak parmağını sıkıştırdıktan sonra arka pençenin geri çekilmemesi veya göz kırpma refleksinin olmaması. Sonra hemen giyotin ile kafayı kesin. Gözleri bir çift iris makasıyla çıkarın ve pH 7.4'te 0.1 M fosfat tamponunda (PB) %4 paraformaldehit içeren bir cam kaba koyun.
- Diseksiyon mikroskobunu kullanarak, göz küresinin ön tarafını keserek korneayı çıkarın. Lensi ve vitreusu forseps ile iç retina yüzeyinden çıkarın.
- Retina göz adaptöründen izole edilene kadar sklerayı iki forseps ile soyun.
- Retinayı hemen bir ustura ile 100 - 200 μm kalınlığında şeritler halinde kesin ve pH kaydırma fiksasyonuna tabi tutun.
- Retina şeritlerini 20 - 30 dakika boyunca pH 6.0'da 0.1 M PB'de% 4 paraformaldehit içinde ve daha sonra oda sıcaklığında (RT) 10 - 20 dakika boyunca pH 10.5'te% 4 paraformaldehit ve% 0.01 glutaraldehit içinde sabitleyin.
- PB'de 0.15 mM CaCl2 (4 ° C'de pH 7.4) ile birkaç yıkamadan sonra, retina şeritlerini gliserol ile kriyoproteksiyon (her biri %10, %20, %30'da 60 dakika, daha sonra gece boyunca [O / N] %30'da) dondurma ikamesinden önce 0.1 M PB'de.
2. Dondurma ikamesi
NOT: Bu dondurma ikame yöntemi, daha önce yayınlanmış bir protokolden değiştirilmiştir. Ayrıca, aletlerin çok soğuk olması çok önemlidir (eldiven giyin); Aksi takdirde, aletlerle dokunulduğunda doku kısmen çözülebilir. Bu adımların tümü otomatik dondurma ikame (AFS) haznesi içinde yapılır ve aletlerin haznenin kenarının üzerine çıkmasına asla izin verilmez. Benzer şekilde, AFS'de kullanılan tüm kimyasalların uygun şekilde soğutulması gereklidir.
- Retina şeritlerini bir elektron mikroskobu (EM) kriyoprezervasyon cihazında (CPC) -184 ° C'de sıvı propan içinde daldırın-dondurun. İnce bir fırça kullanarak, numuneleri, daldırma çubuklarının ucuna giden metal saplamalara tutturulmuş küçük çift yapışkanlı bant parçalarına yerleştirin (fırçayı kullanarak fazla tamponu fitilleyin).
- Çubukları sıvı propanın içine daldırın ve yaklaşık 5 saniye orada tutun ve ardından sıvı nitrojen (LN2 soğutmalı kriyo-transfer kabı) ile doldurulmuş küçük bir taşıma odası kullanarak otomatik dondurma ikame cihazına (AFS) aktarın.
- Donmuş numuneyi ve aletleri (forseps ve neşter) AFS'ye yerleştirdikten sonra, dokuya dokunmadan önce aletleri haznede birkaç dakika soğutun veya aletlerin uçlarını birkaç saniye boyunca küçük taşıma haznesine (sıvı nitrojen (LN2 soğutmalı kriyo-transfer kabı ile doldurulmuş) yerleştirerek soğutun.
- AFS'ye girdikten sonra, İnce bir neşter kullanarak numuneyi ve bandı saplamadan çıkarın. Ayrıca, bu prosedürler sırasında nitrojen gazı akış kontrolünü, TF'yi (TF, 'LN2 buharlaştırıcı için regülatör kontrolü' olarak tanımlanır) açık tutun.
- Donmuş dokuyu düz gömme tutuculara yerleştirmeden önce (yani , AFS'yi kurmadan önce), şeffaf plastik bir tabakadan ince bir daire kesin ve her bir oyuğun altını kaplamak için tutucunun dibine yerleştirin. Bu, bittiğinde polimerize numune bloklarının nispeten daha kolay çıkarılmasını sağlar.
NOT: Önceden, düz gömme tutuculara alternatif bir yöntem kullanıyorduk ve çift Reichert + jelatin kapsüller kullanıyorduk. - AFS'de aşağıdaki otomatik sırayı kullanın (cihaz terminolojisini kullanarak): T1 = 32 saat için -90°C, S1 = sıcaklığı 4°C/saat (11,3 saat) artırın, T2 = 50 saat için -45°C, S2 = sıcaklığı 5°C/sa (9 saat) artırın, T3 = 0 saat için 40°C (toplam = 142,3 saat). Zamanlanmış diziye başlamadan önce numunelerin AFS'ye (-90°C'de) yerleştirilmesi 2 - 4 saat sürebilir.
- Donmuş bölümleri AFS'de >32 saat boyunca -90°C'de metanol içinde %1,5 uranil asetata daldırın. Düz gömülü alüminyum tutucudaki yedi kuyucuğun her birine (tipik olarak) iki parça doku yerleştirin (üçü AFS'ye sığar).
- Doku + bandı kuyucuklardaki uranil asetat / metanolün içine yerleştirin ve dokuyu banttan çıkarmak çok zorsa, gömme ortamı (Lowicryl HM20 gibi) sızmasına başlamadan hemen önce bandı çıkarın.
- Ardından sıcaklığı kademeli olarak -45°C'ye (saatte +4°C; otomatik sırayla) yükseltin.
- Numuneleri önceden soğutulmuş metanol içinde, eski solüsyonu her bir düz gömme tutucudan çıkarmak için ince uçlu bir plastik pipet kullanarak ve ardından önceden soğutulmuş taze metanolü eklemek için başka bir standart plastik pipet kullanarak üç kez yıkayın.
- Daha sonra, aynı yöntemi kullanarak, gömme ortamı (1: 1 ve 2: 1'de HM20 / metanol, her biri 2 saat boyunca, ardından 2 saat boyunca saf reçine ve ardından reçineleri değiştirin ve O / N'yi koruyun) gibi düşük sıcaklıkta gömme reçineleri ile aşamalı olarak sızın.
- Ertesi gün reçineyi tekrar değiştirin ve reçine seviyesini kuyuların hemen üst kenarına ulaşacak şekilde ayarlayın.
- Numuneleri ultraviyole (UV) ışıkla 40 saat boyunca polimerize edin (otomatik sırayla -45°C ila 0°C; saatte +5°C).
- Ardından numuneleri AFS'den çıkarın. Tipik olarak, örnek bloklar hala renkte bir miktar pembelik gösterir. Numuneleri kimyasal çeker ocaktaki floresan ışığının yakınına, tamamen berrak görünene kadar RT O/N veya daha uzun süre yerleştirin.
3. EM İmmünogold İmmünositokimya
- Ultramikrotom ile 1 μm'lik kesitler kesin, bölümleri %1 toluidin-mavi ile boyayın ve kesit oryantasyonu açısından inceleyin; En uygun enine kesit düzlemini elde etmek için doku bloğunu yönlendirin.
- Ultramikrotom ile 70 nm kalınlığında ultra ince kesitler kesin ve bunları Formvar-karbon kaplı nikel yarık ızgaralarında toplayın.
- Izgaraları damıtılmış H2O'da bir kez yıkayın, ardından üç kez Tris tamponlu tuzlu su ile yıkayın (TBS, 0.05 M Tris tamponu, %0.7 NaCl, pH 7.6) yıkayın.
- Izgaraları TBS'de 20 μl'lik %5 sığır serum albümininde (BSA) 30 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra keçi anti-kolera toksin alt birimi B (anti-CTB, 1: 3.000) ve bir N-metil-D-aspartat reseptörü (NMDAR) alt birimine (tavşan önleyici glutamaterjik NMDAR alt birimi A [GluN2A] 1:50, GluN2B 1:30) veya bir anti-tavşan GluA2/3 (heterotetrametik α-amino-3-hidroksi-5-metil-4-izoksazolepropiyonik asit [AMPA] reseptörü, 1:30) TBS-Triton'da (TBST, %0.01 Triton X-100, pH 7.6) %2 BSA ve 0.02 M NaN3 O/N ile RT'de.
- Izgaraları 10, 10 ve 20 dakika boyunca üç ayrı damla (20 μl) TBS (pH 7.6) üzerinde yıkayın, ardından 5 dakika boyunca TBS (pH 8.2) izleyin.
- Izgaraları 2 saat boyunca inkübe edin %2 BSA ve 0.02 M NaN3 ile TBST'de (pH 8.2) 10 nm altın parçacıklarına bağlı eşek anti-tavşan immünoglobulin G (IgG, 1:20) ve eşek anti-keçi IgG (1:20) içeren bir karışımın damlaları (20 μl).
- Izgaraları 20 μl TBS damlalarında (pH 7.6) 5, 5 ve 10 dakika, ardından ultra saf suda yıkayın ve ardından kurutun.
- Damıtılmış H2O içinde %5 uranil asetat ve %0.3 kurşun sitrat içeren karşı boyama ızgaralarını karanlık koşullar altında sırasıyla 8 ve 5 dakika boyunca temizleyin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Paraformalaldehyde | EMS | 15710 | |
| Glutarldehyde | EMS | 16019 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 7782-85-6 | |
| CaCl2 | Sigma | C-8106 | |
| BSA | Sigma | A-7030 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | |
| NaN3 | JT Baker | V015-05 | |
| Glycerol | Gibco BRL | 15514-011 | |
| Lowicryl HM 20 | Polysciences | 15924-1 | |
| Tris-Base | Fisher | BP151-500 | |
| Tris | Fisher | 04997-100 | |
| Anti-GluN2A | Millipore | AB1555P | Seyreltme 1/50< |
| Millipore | AB1557P | Seyreltme 1/30< | |
| Milipore | AB1506 | Seyreltme 1/30< | |
| Millipore | MA1–046 | Seyreltme 1/100 | |
| Eşek anti-tavşan IgG-10 nm altın parçacıkları | EMS | 25704 | Seyreltme 1/20< |
| EMS | 25814 | Seyreltme 1/20 | |
| Eşek anti-fare IgG-5 nm altın parçacıkları | EMS | 25812 | Seyreltme 1/20< |
| Jackson ImmunoResearch | 705-215-147 | Seyreltme 1/20< | |
| EMS | FCF2010-Ni | ||
| Uranil asetat | EMS | 22400-1 | |
| Metanol | EMS | 67-56-1 | |
| Kurşun sitrat | Leica | ||
| Leica EM AFS | Leica | ||
| Leica EM CPC | Leica | ||
| Ultromicrotome | Leica | ||
| JEOL 1200 EM | JEOL | ||
| sıvı nitrojen | Roberts Oxygen | ||
| Propan | Roberts Oxygen | ||
| CTB | List Biological Laboratories | 104 | 1-1.2% |
| Anti-CTB | List Biological Laboratories | 703 | Seyreltme 1/4000 |
