Rekombinant hücrelerde koku reseptörü aktivasyonunun gerçek zamanlı izlenmesi

Özet

Kaynak: de March, C. A. et. al., Buhar Fazındaki Bir Koku Maddesi Tarafından Koku Reseptörü Aktivasyonunun Gerçek Zamanlı İn Vitro İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, lüminesans ölçümü kullanarak rekombinant memeli hücrelerinde koku reseptörlerinin gerçek zamanlı aktivasyonunu izleme yöntemini göstermektedir. Koku bağlanması, G-protein aktivasyonunu ve cAMP üretimini tetikler, substrat bağlanması üzerine ışıldama yayan glosensör proteinlerini aktive eder ve reseptör yanıtının kantitatif bir ölçüsünü sağlar.

Protokol

1. Hana3A Cells Culture

1. M10 (Minimum Esansiyel Orta (MEM) artı %10 v/v fetal sığır serumu (FBS)) ve M10PSF (M10 artı 100 μg/mL penisilin-streptomisin ve 1.25 μg/mL amfoterisin B) hazırlayın.
2. Hücreleri 10 mL M10PSF'de 37 °C ve %5 karbondioksit (CO2) ayarlanmış bir inkübatörde 100 mm'lik bir hücre kültürü kabında kültürleyin.
3. Hücreleri her 2 günde bir% 20 oranında bölün: ....

Sonuçlar

Şekil 1: Buharlaştırılmış koku verici ile koku verici reseptör aktivasyonunun gerçek zamanlı izlenmesi için şematik protokoller. Koku verici (menekşe), mineral yağ (A) içinde iste.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054<
100 mm hücre kültürü tabağı	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm hücre kültürü tabağı
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm konik tüpler
96 oyuklu plate	Corning	3843	96 iyi, LE kapaklı beyaz ve şeffaf alt Poli-D-lizin kaplı Polistiren<
Gibco	15290-018	Amfoterisin B 250 μg/mL - 4 °C'de
Centrifuge machine	Jouan	C312<
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE
NU-407-500<
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Boval Serum - -20 °C'de
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reaktif ışıldayan protein substratı - -20 °C'de saklayın
Kuluçka makinesi 37 °C; %5 karbon dioksit	Fisher Scientific	11-676-604	Hücre kültürü
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reaktif 1mg/ml transfeksiyon reaktifi - 4 ° C'de saklayın C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	durduruldu	96 kuyulu lüminesans
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants - oda sıcaklığında saklayın
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Earle's tuzları ve L-glutamin içeren Minimum Essential Medium Eagle - 4 °C'de saklayın
Penicillin/Streptomycin<	P4333	10.000 U penisilin ve 10 mg streptomisin ile stabilize edilmiş penisilin-Streptomisin çözeltisi - -20 °C'de
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP ışıldayan protein plazmidi - 4 °C'de
Faz kontrast mikroskobu	Leica	090-131.001	x4, x10, x20 objektifli faz kontrast mikroskobu
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/μL plazmid -

td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>0.05% Tripsin - EDTA (1x), fenol kırmızısı - 4 °C'de saklayıntd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Amfotericin saklayıntd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>15 mL için sallanan kova rotorlu santrifüj makinesitd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Hücre kültürü için fümehood saklayıniçin kuluçka makinesiiçin plaka okuyucutd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:top;'>Sigma Aldrich saklayın saklayın 4°C'de saklayın