Rekombinant hücrelerde koku reseptörü aktivasyonunun gerçek zamanlı izlenmesi

Özet

Kaynak: de March, C. A. et. al., Buhar Fazındaki Bir Koku Maddesi Tarafından Koku Reseptörü Aktivasyonunun Gerçek Zamanlı İn Vitro İzlenmesi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu video, lüminesans ölçümü kullanarak rekombinant memeli hücrelerinde koku reseptörlerinin gerçek zamanlı aktivasyonunu izleme yöntemini göstermektedir. Koku bağlanması, G-protein aktivasyonunu ve cAMP üretimini tetikler, substrat bağlanması üzerine ışıldama yayan glosensör proteinlerini aktive eder ve reseptör yanıtının kantitatif bir ölçüsünü sağlar.

Protokol

1. Hana3A Cells Culture

1. M10 (Minimum Esansiyel Orta (MEM) artı %10 v/v fetal sığır serumu (FBS)) ve M10PSF (M10 artı 100 μg/mL penisilin-streptomisin ve 1.25 μg/mL amfoterisin B) hazırlayın.
2. Hücreleri 10 mL M10PSF'de 37 °C ve %5 karbondioksit (CO2) ayarlanmış bir inkübatörde 100 mm'lik bir hücre kültürü kabında kültürleyin.
3. Hücreleri her 2 günde bir% 20 oranında bölün: faz kontrast mikroskobu altında% 100 hücrelerin birleşmesi (yaklaşık 1.1 x 10⁷ hücre) gözlendiğinde, ortamı aspire edin ve hücreleri 10 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın.
4. PBS'yi aspire edin ve 3 mL %0.05 tripsin-etilen diamin tetraasetik asit (EDTA, 0.48 mM) ekleyin. Hücreler plakadan ayrılana kadar yaklaşık 1 dakika etki etmesine izin verin.
5. Tripsini etkisiz hale getirmek için 5 mL M10 ekleyin ve sonunda yukarı ve aşağı pipetleyerek hala plakaya bağlı hücreleri ayırın.
6. Hacmi (8 mL) 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve herhangi bir hücre kütlesini kırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri 5 mL M10PSF'ye yeniden süspanse edin. Tüpte kabarcık oluşturmaktan kaçının.
7. 1 mL yeniden süspanse hücre solüsyonunu 100 mm'lik yeni bir hücre kültürü kabına aktarın ve 9 mL taze M10PSF ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 CO_2'de inkübe edin.

2. Transfeksiyon için Hücrelerin Hazırlanması

1. Birleşmeyi veya hücre sayısını, onları bir faz-kontrast mikroskobu altında gözlemleyerek değerlendirin. Bir plaka için en az% 10 birleşme (yaklaşık 1.1 x 10⁶ hücre) gereklidir.
2. Besiyerini aspire edin ve hücreleri 10 mL PBS ile nazikçe yıkayın. PBS'yi aspire edin ve 3 mL EDTA ekleyin. Hücreler plakadan ayrılana kadar oda sıcaklığında yaklaşık 1 dakika etki edin.
3. Tripsini etkisiz hale getirmek için 5 mL M10 ekleyin ve sonunda yukarı ve aşağı pipetleyerek hala plakaya bağlı hücreleri ayırın. Hacmi (8 mL) 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
4. Süpernatanı aspire edin ve herhangi bir hücre kütlesini kırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri 5 mL M10PSF'ye yeniden süspanse edin. Tüpte kabarcık oluşturmaktan kaçının.
5. Transfekte edilecek plakaların sayısına bağlı olarak, uygun miktarda hücreyi, karşılık gelen M10PSF hacmine sahip bir rezervuara aktarın. 96 oyuklu bir plaka, toplam 6 mL hacme ulaşmak için M10PSF içinde seyreltilmiş% 100 birleşik 100 mm'lik bir kabın (yaklaşık 1.1 x 10⁶ hücreli) 1 / 10'u ile kaplanmalıdır. % 100 birleşme 100 mm'lik bir tabakla başlayan 96 oyuklu bir plaka için, 5 mL yeniden süspanse edilmiş hücrelerden 5.5 mL taze M10PSF'ye 500 μL ekleyin. Hücreleri ve M10PSF'yi hava kabarcıkları oluşturmadan karıştırın.
6. Çok kanallı bir pipet kullanarak 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 50 μL asılı hücreler pipetleyin. Gece boyunca 37 °C ve %5 CO_2'de inkübe edin.

3. Plasmid Transfection

1. %30 ile %50 arasında bir hücre birleşmesi sağlamak için 96 oyuklu plakayı faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin.
2. Tablo 1'deki hacimleri takip ederek tüm plaka için ortak olan plazmitleri (reseptör taşıyan protein 1'in (RTP1S), koku reseptörü (OR) ve Glosensor proteininin daha kısa bir versiyonu; Malzeme Tablosuna bakın) içeren bir ilk transfeksiyon karışımı hazırlayın. Rho etiketli OR miktarının, birkaç OR ise OR sayısına bölünmesi gerektiğine dikkat edin.
   NOT: Deney planına boş bir vektör negatif kontrolü (burada Rho-pCI) ve herhangi bir pozitif kontrolü (VEYA test edilen koku maddesine yanıt verdiği bilinmektedir) eklemenizi şiddetle tavsiye ederiz.
3. 500 μL MEM ve 20 μL Lipofectamine 2000 reaktifi içeren ikinci bir transfeksiyon karışımı hazırlayın (bir 96 oyuklu plaka için geçerlidir, Malzeme Tablosuna bakın). İkinci karışımı birinciye ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 5 mL M10 ekleyin ve hafifçe karıştırın.
4. Önceden kaplanmış 96 oyuklu plakadaki M10PSF'yi 50 μL son transfeksiyon ortamı ile değiştirin. 37 °C ve% 5 CO_2'ye ayarlanmış bir inkübatörde inkübe edin ve luminometrenin haznesini gece boyunca vakumlayın.

4. Substrate Incubation

1. %60 ile %100 arasında bir hücre birleşmesi sağlamak için 96 oyuklu plakayı faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin. 10 mM hidroksietil piperazineetansülfonik asit (HEPES) ve 5 mM D-glikoz içeren Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisinin (HBSS) bir simülasyon çözeltisini hazırlayın.
2. 75 μL siklik adenozin monofosfat (cAMP) reaktifi (Malzeme Tablosuna bakınız) solüsyonunu 2,75 mL stimülasyon solüsyonuna seyreltin. Transfeksiyon ortamını 96 oyuklu plakadan çıkarın ve her oyuğa 50 μL taze stimülasyon solüsyonu ekleyerek hücreleri yıkayın.
3. Stimülasyon solüsyonunu çıkarın ve her bir oyuğa adım 4.2'de hazırlanan 25 μL cAMP reaktif solüsyonu ekleyin. 96 oyuklu plakayı oda sıcaklığında karanlık ve kokusuz bir ortamda (örneğin, kimyasallardan veya herhangi bir koku kaynağından uzakta temiz, boş bir çekmece) 2 saat inkübe edin.

5. Odorant Stimulation

1. İlk olarak, luminometre odasını uçucu koku molekülleri ile dengeleyin. Koku maddesini 10 mL mineral yağda istenen konsantrasyona seyreltin (Şekil 1A). cAMP reaktif inkübasyon süresinin bitiminden önce, 25 μL koku verici çözeltiyi 96 oyuklu yeni bir plakaya (hücreleri içeren plakaya değil) ekleyin. Bu koku verici plakayı oda sıcaklığında luminometre odasında 5 dakika inkübe edin (Şekil 1B) (burada luminometre kaydı gerekli değildir).
2. Luminometreyi, döngüler arasında 0,7 s'lik aralıkla 90 s'lik 20 döngü plaka ölçümü sırasında 0 sn gecikmeyle lüminesansı kaydedecek şekilde ayarlayın.
3. Plakayı okumadan hemen önce, koku plakasını hazneden çıkarın. Hücreleri içeren 96 oyuklu plakanın oyukları arasına 25 μL koku verici ilave ediniz (hücreleri içeren oyuklara koku verici ilave etmeyiniz) ve 30 dakika içinde 20 döngü boyunca tüm kuyucukların lüminesans ölçümünü hızlı bir şekilde başlatın (Şekil 1C).

Tablo 1: Transfeksiyon için karıştırın. 96 oyuklu bir plakaya transfekte etmek için MEM'e eklenecek plazmit miktarları (Glosensör proteini, RTP1S ve OR).

	96 oyuklu plaka başına
MEM	500 μL
pGlosensor	10 ng
RTP1S	5 ng
VEYA	75 ng

 

Sonuçlar

Şekil 1: Buharlaştırılmış koku verici ile koku verici reseptör aktivasyonunun gerçek zamanlı izlenmesi için şematik protokoller. Koku verici (menekşe), mineral yağ (A) içinde iste...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
0.05 % trypsin-EDTA	Gibco	25300-054<
100 mm hücre kültürü tabağı	BD Falcon	353003	100 mm x 20 mm hücre kültürü tabağı
15 mL tube	BD Falcon	352099	17 mm x 120 mm konik tüpler
96 oyuklu plate	Corning	3843	96 iyi, LE kapaklı beyaz ve şeffaf alt Poli-D-lizin kaplı Polistiren<
Gibco	15290-018	Amfoterisin B 250 μg/mL - 4 °C'de
Centrifuge machine	Jouan	C312<
Class II Type A/B3 fumehood	NUAIRE
NU-407-500<
FBS	Gibco	16000-044	Fetal Boval Serum - -20 °C'de
GloSensor cAMP Reagent	Promega	E1290	GloSensor cAMP Reaktif ışıldayan protein substratı - -20 °C'de saklayın
Kuluçka makinesi 37 °C; %5 karbon dioksit	Fisher Scientific	11-676-604	Hücre kültürü
Lipofectamine 2000 reagent	Invitrogen	11668-019	Lipofectamine 2000 Reaktif 1mg/ml transfeksiyon reaktifi - 4 ° C'de saklayın C
Luminometer POLARstar OPTIMA	BMG LABTECH	durduruldu	96 kuyulu lüminesans
Mineral oil	Sigma	M8410	Solvent for odorants - oda sıcaklığında saklayın
Minimum Essential Medium (MEM)	Corning cellgro	10-010-CV	Earle's tuzları ve L-glutamin içeren Minimum Essential Medium Eagle - 4 °C'de saklayın
Penicillin/Streptomycin<	P4333	10.000 U penisilin ve 10 mg streptomisin ile stabilize edilmiş penisilin-Streptomisin çözeltisi - -20 °C'de
pGlosensor	Promega	E2301	pGloSensor-22F cAMP ışıldayan protein plazmidi - 4 °C'de
Faz kontrast mikroskobu	Leica	090-131.001	x4, x10, x20 objektifli faz kontrast mikroskobu
RTP1S	H. Matsunami lab	-	100 ng/μL plazmid -

td style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>0.05% Tripsin - EDTA (1x), fenol kırmızısı - 4 °C'de saklayıntd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Amfotericin saklayıntd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>15 mL için sallanan kova rotorlu santrifüj makinesitd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Hücre kültürü için fümehood saklayıniçin kuluçka makinesiiçin plaka okuyucutd style='background-color:#ffffff;padding:0px 3px;text-align:center;vertical-align:top;'>Sigma Aldrich saklayın saklayın 4°C'de saklayın