Işığa duyarlı bir boya kullanarak fare beyninde kan pıhtısı oluşumuna neden olmak

Özet

Kaynak: Talley Watts, L., et al. İn Vivo Konfokal Optik Görüntüleme ile Rose Bengal Fototrombozu: Tek Damar İnme Modeli. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, bir fare beyninde kan pıhtısı oluşumunu indüklemek için bir tekniği göstermektedir. Kraniyal bir pencereye ve inceltilmiş bir kafatasına sahip anestezi uygulanmış bir fare, yüksek yoğunluklu ışık kullanılarak ışığa duyarlı bir boyanın aktivasyonu yoluyla fototromboza uğrar. Bu süreç, damar duvarlarına zarar veren ve pıhtı oluşumunu tetikleyen ve sonuçta beyne giden kan akışını engelleyen reaktif oksijen türleri üretir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Kortikal Hazırlık için Anestezi

1. Fareyi, anesteziyi indüklemek için oksijenle karıştırılmış %2-3 izofloran içeren bir indüksiyon odasına yerleştirin. Fare indüklendiğinde solunum hızının azaldığını gözlemleyin. Farenin burun konisine hareket etmeye hazır olup olmadığını belirlemek için farenin pençesini sıkıştırın. Not: Anestezi seviyesi, herhangi bir in vivo hazırlığında kritik bir adımdır ve global iskemiye neden olacak bir seviyenin indüklenmemesine özen gösterilmelidir.
2. Fare yeterince uyuşturulduktan sonra, hayvanı ameliyat/görüntüleme platformuna aktarın ve farenin burnunu burun konisine yerleştirin ve anestezi durumunu korumak için %1-1.2 izofloran uygulayın. Kalan prosedürler boyunca vücut sıcaklığını (37°C +/- 0.5°C) korumak için farenin sıcaklık kontrollü bir ısıtma yastığı üzerinde yattığından emin olun. Anestezi altındayken kuruluğu önlemek için gözlerin üzerine veteriner merhemi sürün.
3. Sistemle birlikte verilen kuyruk veya ayak klipsini kullanarak bir nabız oksimetre sistemi kullanarak farenin fizyolojisini izleyin. Solunum hızının 50-65 nefes/dk arasında tutulduğunu kontrol edin. Hayvanın uzun süreli hayatta kalmasını sağlamak için kalp atış hızının 300 ila 450 bpm arasında kaldığını ve oksijen satürasyonunun %97-98 arasında tutulduğunu kontrol edin.
4. Fare yeterince uyuşturulduğunda, elektrikli makas kullanarak kafatası üzerindeki tüyleri tıraş edin, kalan tüyleri alın ve betadin ile temizleyin, ardından bir etanol çubuğu uygulayın. Steril bir cerrahi ortam sağlamak için bu işlemi üç defaya kadar tekrarlayın.

2. Cerrahi İşlem

1. Kafa derisi tamamen temizlenmiş ve traş edilmişken, kraniyal fissürleri ortaya çıkarmak ve bregmayı bulmak için farenin kafa derisinde 5 mm'lik bir kesi yapın.
2. Kafatasının üzerinde kalan fasyayı çıkarmak için steril bir pamuklu aplikatör kullanın.
3. Özel yapım paslanmaz çelik bir halkayı (Şekil 1) doku yapıştırıcısı ile Bregma'nın stereotaksik koordinatlarını kullanarak parietal korteksin üzerindeki kemiğe yapıştırın: -1 ila -3 mm ve lateral: 2-4 mm. Not: Yapıştırıcı tipik olarak halkanın kemiğe yerleştirilmesinden sonra 2 dakika içinde sertleşir.
4. Fareyi stabilize etmek ve görüntüleme sırasında hareket etmesini önlemek için halkayı stereotaksik bir tutucuya (Şekil 2) takın.
5. Cerrahi sınıf diseksiyon mikroskobu altında, hız kontrollü dremel benzeri bir alet (Meisinger 3,9 mm matkap ucu) kullanarak kafatasında 1-2 mm'lik bir bölümü yavaşça delin ve delinirken alanı düz tuttuğunuzdan emin olun. Bunu zikzak bir desen kullanarak başarın. Isı birikmesini önlemek için matkap hızını düşük olarak ayarlayın ve sık sık ara verin.
6. Kraniyal kafatası görünüşte parlak hale geldiğinde, ince kraniyal kafatası tabakalarının düzgün bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırmak için inceltilmiş yüzey seviyesini korumak için aynı zikzak desenini kullanan bir neşter bıçağı kullanarak kafatasının inceltilmesine devam edin. Neşter bıçağının ucunu kullanarak, bir seferde ince kemik katmanlarını çıkarmak için hafif basınçla küçük doğrusal vuruşlar yapın. Damar sistemi diseksiyon mikroskobu ile net bir şekilde görünene kadar devam edin.
7. Deneyci, inceltme işlemi sırasında kafatasını deler veya kırarsa, altta yatan kortekste olası hasar nedeniyle hayvana ötenazi yapın.
   Not: Fare kafatası yaklaşık 300 μm kalınlığındadır ve iki ince kompakt kemik katmanından (bir dış ve bir iç katman) ve iki kompakt kemik katmanı arasına sıkıştırılmış süngerimsi bir kemik katmanından oluşur. Kompakt kemiğin dış tabakası ve süngerimsi kemiğin çoğu 5 mm'lik delme alanı içinde çıkarılır ve yaklaşık 50 μm'lik bir kompakt kemik tabakası kalır (bkz. Şekil 2B). Damar sisteminin görselleştirilmesi, nihai sağlam incelmiş kafatasının yaklaşık 50 μm kalınlığında olmasını sağlayacaktır. Bu nedenle kafatası, bu kalınlığa kadar inceltildiğinde hala mevcuttur.

3. Mikroskop Kurulumu

1. Objektif bir invertöre sahip ters çevrilmiş bir mikroskop sistemi (geleneksel, konfokal veya iki fotonlu sistemler) kullanın. Not: Standart bir dik mikroskop kullanmak da mümkündür. Sınırlayıcı faktör, sahne ile hedefler arasındaki boşluk olacaktır. Bu kurulumu gerçekleştirmek için sahne alanında değişiklikler yapılması gerekebilir.
2. Cerrahi/görüntüleme platformunu, mikroskobun tabanının yanında bulunan özel yapım bir sahneye sabitleyin. Not: Platform, cerrahi/görüntüleme platformunun objektif altında dikey hareketine izin vermek için bir laboratuvar jakı kullanılarak yapılmıştır. Laboratuvar krikosu, dört silindirik direğe yapıştırılmış bir plakaya monte edilmiştir. (Bkz. Şekil 2).
3. 20X objektif içeren objektif invertörünü kraniyal pencerenin üzerine yerleştirin. Mikroskobun göz merceklerinden bakarak kafatası penceresini bulmak için harici bir ışık kaynağı kullanın ve objektifi görüntüleme alanına yerleştirin. Not: Görüntüleme alanı, damar sisteminin varlığı ile gösterilecektir.
4. Su bazlı hedefler için, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) (130 mM NaCl; 30 mM KCl; 12 mM KH₂PO₄; 200 mM NaHCO₃; 30 mM hidroksietilpiperazin etan sülfonik asit [HEPES]; ve 100 mM glikoz) görüntüleme sırasında kraniyal boşluğa potansiyel sızıntı nedeniyle ortam olarak kullanın (Şekil 3).

4. Gül Bengal Boyası İnme Hazırlama, Uygulama ve İndüksiyon

1. aCSF'de 20 mg / ml taze bir Gül Bengal çözeltisi hazırlayın; Uygulamadan önce süzün ve sterilize edin. Rose Bengal'i karıştırıldıktan sonra tekrar kullanmayın veya saklamayın. Her deney için yeni bir çözüm hazırlayın.
2. Çözeltinin yeterli enjeksiyonunu sağlamak için kraniyal pencereyi 561 nm lazerle tararken 0.1 ml Rose Bengal kuyruk damarı enjeksiyonu yapın. Not: Rose Bengal, beynin damar sistemine enjeksiyondan sonra 5 saniye içinde görüntülenecektir. Tüm gemi Rose Bengal ile doldurulmalıdır.
3. Yeterli Rose Bengal boyası enjeksiyonunu takiben, belirli bir lezyon hacminin tekrarlanabilirliğini sağlamak için damar çapına (40-80 μm) dayalı olarak tromboz için uygun bir damar seçin. Kan akış yönüne bakarak arterler ve damarlar arasında ayrım yapın: arterler daha büyük çaptan daha küçük çaplı damarlara doğru hareket eder, damarlar daha küçük çaptan daha büyük çaplı damarlara doğru hareket eder. Bu, Rose Bengal enjekte edildikten sonra görselleştirme ile kolayca gerçekleştirilir.
4. Mikroskop ayarını aşağıdaki gibi değiştirin:
   1. Bekleme süresini artırın. Not: Bu, kullanılan mikroskop sistemine bağlı olarak değişecektir.
   2. Lazer gücünü% 100'e yükseltin.
   3. Maksimum tarama hızını kullanarak zaman dizisi görüntülerini 1 kare/sn'de toplayın.
5. Damar içinde stabil bir pıhtı oluşana kadar fareyi tarayın. Not: Bu genellikle sürekli taramadan sonraki 5 dakika içinde gerçekleştirilir (Bkz. Şekil 4).
6. Rose Bengal kullanılarak pıhtı oluşumunun indüksiyonunu takiben, fareyi görüntüleme alanından diseksiyon mikroskobuna geri çıkarın. Paslanmaz çelik halkayı kraniyal kafatasından dikkatlice çıkarın. Herhangi bir kanama için kraniyal pencereyi inceleyin. Kanama olursa, deneyi sonlandırın.
7. Kafatası üzerindeki kesiği kapatmak için 6.0 monofilament sütür kullanın. Enfeksiyonu önlemek için dikiş hattı boyunca antibiyotik merhem yerleştirin. Ağrı yönetimi için Buprenex'i (0.05 mg / kg) üç gün boyunca her 12 saatte bir deri altına enjekte edin.
8. Anesteziden çıkarıldıktan sonra fareyi tamamen uyanana ve serbestçe hareket edene kadar bir kurtarma odasına geri koyun.
9. Daha sonra daha fazla araştırma yapmak için fareyi temiz bir kafese geri koyun.

Sonuçlar

Şekil 1: Paslanmaz Çelik Yüzük. Stereotaksik tutucuya sabitlemek için farenin kafatasına uygulanan paslanmaz çelik halka tutucunun üç görünümü (üst, yan ve alt görünümler) gösterilmektedir.

Malzemeler