Dorsal Kök Ganglion Enjeksiyonu ve Dorsal Kök Ezilme Yaralanması Kullanılarak Bir Sıçanda Duyusal Akson Rejenerasyonunun Modellenmesi

Özet

Kaynak: Cheah, M., et al. Duyusal akson rejenerasyonu için bir model olarak dorsal kök ganglion enjeksiyonu ve dorsal kök ezilme yaralanması. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, dorsal kök gangliyonlarına (DRG'ler) viral bir süspansiyon enjekte etmek ve anestezi uygulanmış bir sıçanda dorsal kök ezmesi yoluyla kontrollü bir aksonal yaralanmayı indüklemek için adım adım bir prosedürü göstermektedir. Protokol, DRG'lerin açığa çıkarılmasını, aksonal rejenerasyonu kolaylaştırmak için büyümeyi teşvik eden bir viral vektörün verilmesini ve duyusal sinir yaralanması ve rejenerasyonunu modellemek için omuriliğe aksonal bağlantıların kesilmesini içerir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. DRG Enjekte Edilmesi ve Dorsal Kök Ezilme Yaralanması Yapılması

NOT: Bu son derece hassas bir ameliyattır. Canlı hayvan cerrahisine geçmeden önce anatomiye aşina olmak için önce birkaç ölü hayvan üzerinde pratik yapmanız önerilir.

1. Deri üzerinde belirgin C2 ve T2 spinöz süreçlerini bulun. 10 numaralı bir neşter bıçağı ile C2 ve T2 spinöz süreçleri arasında bir cilt kesisi yapın (cilt açıldıktan sonra, kasın ilk tabakasında beyaz, fibröz doku orta hattı görünmelidir; ilk kas tabakası "jöle benzeri" bir dokuya sahiptir).
2. Bir neşter bıçağı kullanarak beyaz orta hat boyunca ilk kas tabakası üzerinde benzer büyüklükte bir kesi yapın. Belirgin T2 spinöz sürecinin ötesine geçmeyin, çünkü oraya yakın bir yerde inen aorttan büyük bir arteriyel dal vardır.
   NOT: Bu adımdan itibaren herhangi bir yerde ağır kanama meydana gelebilir. Her zaman net görselleştirme sağlamak için sterilize edilmiş pamuklu çubuklar veya cerrahi emilebilir süngerler kullanarak kanamayı durdurun ve kanı alın. Prosedüre "körü körüne" devam etmek, omurilik, DRG veya sırt kökünde istenmeyen hasara neden olabilir ve bu da daha sonra hayvanda beklenmedik olumsuz etkilere yol açabilir.
3. Biri rostral ve diğeri kaudal olarak yerleştirilmiş iki ekartör kullanarak ilk kas tabakasını geri çekin; Çizgili bir görünüme sahip ikinci kas tabakası görünür olmalıdır.
4. İkinci kas tabakasının orta hattını bulun (burada ince, zarlı bir doku ile birbirine bağlı iki uzunlamasına kas gözlemlenebilir). İki uzunlamasına kası ayırmak için bir çift mikromakas kullanarak membranöz dokuyu inceleyin. Mümkünse neşter bıçağı kullanmaktan kaçının, çünkü bu gereksiz kas hasarına ve kanamaya neden olabilir.
5. Omurgayı kaplayan üçüncü ince kas tabakasını ortaya çıkarmak için ekartörleri buna göre ayarlayın. Dikenli süreçler, üçüncü kas tabakası üzerine bir çift forseps ile hafifçe dokunularak hissedilebilir.
6. Mikromakas kullanarak üçüncü kas tabakasında küçük bir kesi yapın ve omurları net bir şekilde ortaya çıkarmak için bir küret veya neşter kullanarak kası kemikten nazikçe kazıyın. Gerekirse, laminektomiyi kolaylaştırmak için kas veya tendonun bir kısmını kesin.
7. Sol C5 - C8 DRG'leri ortaya çıkarmak için, bir çift ince rongeur kullanarak lamina ve pedikülün bir kısmını dikkatlice çıkararak C4 - T1 omurları üzerinde sol hemi-laminektomi yapın. DRG, omurların enine forameninin yakınında bulunur.
   NOT: C3 - C7 omurlarında belirgin bir dikenli süreç yoktur. C5 DRG, C4 ve C5 omurları arasında, C6 DRG, C5 ve C6 omurları arasında bulunur ve bu şekilde devam ederken, C8 DRG, C7 ve T1 omurları arasındadır. C8 DRG ve C8 omurilik segmentinin varlığına rağmen C8 omuru yoktur.
8. Enjeksiyon için yeterli miktarda DRG'ye maruz kaldıktan sonra, özel yapım, 33 gauge künt bir iğne ile donatılmış virüs dolu mikrolitre şırıngayı stereotaksik şırınga tutucusuna yerleştirerek şırıngayı hazırlayın. Enjeksiyondan önce, enjeksiyon iğnesinin yerleştirilmesine yardımcı olmak için hedeflenen DRG'nin her birinde küçük bir yüzeysel açıklık açmak için 30 gauge eğimli bir iğne kullanın.
9. Stereotaksik koordinatları ayarlamak için düğmeleri hafifçe çevirerek 33 gauge iğneyi DRG'nin ortasına yerleştirin. İğneyi aşırı batırmayın, çünkü bu, DRG'nin ventral tarafından sıvının dışarı sızmasına neden olabilir. Sızıntı meydana gelirse, iğnenin konumunu hemen ayarlayın.
   NOT: Sayısal stereotaksik koordinatlar kullanılmaz; Bununla birlikte, iğneyi enjeksiyon için tutmak için çerçeveyi kullanmak yardımcı olur.
10. Bir infüzyon şırınga pompası kullanarak her DRG'ye 0.2 μL / dk'da 1 μL virüs enjekte edin. İğneyi çekmeden önce üç dakika daha bekleyin. Enjeksiyon sırasında, virüs çözeltisi renkli bir boya içeriyorsa, DRG yavaşça renk değiştirecektir.
11. Eşzamanlı bir C5 - C8 sırt kökü ezilme yaralanması gerçekleştirmek için, forsepsin uçlarına tamamen zıt olacak şekilde bir çift ince uçlu forseps (Bonn Micro) kullanarak her bir kökü 10 saniye boyunca üç kez ezin; Ezilme bölgesinde dokuda beyaz bir çizgi görünmelidir. Forseps ile gerekenden daha derine inmeyin, çünkü bu ventral köke zarar verebilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Fast Green FCF dye	Sigma-Aldrich	F7258	Renksiz çözümü görselleştirmek için. Önerilen konsantrasyon: %
Olsen-Hegar Needle Holder	Fine Science Tools	FST 12502-12
Friedman Pearson Rongeur Kavisli 0.7mm Cup	Fine Science Tools	FST 16121-14<
Bonn Micro Forceps	Fine Science Tools	FST 11083-07	For performing dorsal root crush injury
Doku Ayırma Makası	Fine Science Tools	FST 14072-10
Fine Scissors	Fine Science Tools	FST 14058-11<
Micro-Adson Forceps	Fine Science Tools	FST 11018-12
Goldstein Retractor	Fine Science Tools	FST 17003-03
Vannas Spring Scissors (düz)	Fine Science Tools	FST 15018-10<
SURGIFOAM Emilebilir Jelatin Sponge	ethicon	1972	For bleeding control
Microliter Syringe RN701 (10 μl)	Hamilton	80330
Ismar-made Çıkarılabilir İğne (DRG enjeksiyonu için)	Hamilton	7803-05	33 gauge, 38 mm, nokta stili 3
SYS-Micro4 Denetleyicili UltraMicroPump	World Precision Instruments	UMP3-1

1td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:172pt;'> td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:172pt;'> td style='border-left-style:none;border-top-style:none;width:172pt;'>