Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Lazer kaynaklı beyin hasarı deneysel prosedürü
- Lazer grubu olarak işaretlenmiş bir gruba 20 sıçan ve başka bir kontrol grubuna 20 sıçan atayın (sahte ameliyatlı).
- Lazer grubu sıçanları 50J X 10 nokta lazer ışınlamasına tabi tutun:
- {{}}Spontan ventilasyona izin veren oksijende %2 izofluran karışımı ile sıçanı uyuşturun. Geri çekilme refleksinin yokluğunu görmek için kuyruğu forseps ile sıkıştırarak yeterli anestezik derinliği olup olmadığını kontrol edin.
- Rektal sıcaklık ayarlı bir ısıtma yastığı kullanarak deneysel prosedür boyunca sıçanın çekirdek vücut sıcaklığını 37 ° C'de tutun.
- Yerel tüyleri bir tıraş makinesi ile alın ve% 70 alkol ve% 0.5 klorheksidin glukonat ile dezenfekte edin. Dezenfeksiyon adımını iki kez daha tekrarlayın.
NOT: Ameliyat kesisinin boyutu yaklaşık 3 cm olmalıdır. Kesi alanının etrafındaki tüyleri en az 2 cm çıkarın. - Fareyi yüzüstü pozisyonda stereotaksik bir kafa tutucuya yerleştirin ve kafa derisini yanal olarak yansıtmak ve Bregma ile Lambda arasındaki alanı ortaya çıkarmak için 3 cm'lik bir kesi yapın.
- Burun konisinden anesteziyi koruyun.
- Neodimyum katkılı itriyum alüminyum granat (Nd-YAG) lazer (tepe dalga boyu 1064 nm) kullanarak 50J X 10 nokta, 1 s darbe süresi ile kafatasının sağ hemisferin üzerindeki açıkta kalan bölgesine uygulayın.
- Bir lazer ışını üretmek için cihazın lazer üreten kısmının açıkta kalan alandan 2 mm uzaklıkta olduğundan emin olun. 50J X 10 nokta, farklı enerji/yüzey kombinasyonlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesinden sonra seçildi. Bu kombinasyon etkilidir ve bir saniyeden daha kısa bir süre uygulandıktan sonra kafatasında kemik tahribatına neden olmaz.
NOT: 2 mm, lazer ışınının terminali (içinden geçtiği optik kablodan) ile kafatası kemiği arasındaki mesafedir. Odaklama merceği kullanılması durumunda, ışını istenen hasar alanına odaklamak için merceğin eğim açısı dikkate alınarak mesafe hesaplanmalıdır. Uygun eğitim ve göz koruması da dahil olmak üzere bir lazer cihazı kullanırken uygun güvenliği sağlayın. - Fareyi cihazdan çıkarın ve kafa derisini 3-0 ipek cerrahi dikişlerle kapatın.
- Anesteziyi bırakın ve fareyi iyileşmesi için kafesine geri koyun. Ameliyattan hemen sonra postoperatif ağrıyı azaltmak için lokal olarak 0.1 mL% 0.25 bupivakain uygulayın.
NOT: Doğru yapılırsa tüm prosedür 5 dakikadan az sürmelidir.
- Anestezi sonrası iyileşme sırasında herhangi bir sıkıntı belirtisi için fareyi gözlemleyin. Anesteziden çıkmadan önce, postoperatif analjezi için 0.01 mg / kg intramüsküler buprenorfin verin ve en az 48 saat boyunca her 12 saatte bir tekrarlanan dozlarla devam edin.
- Kontrol farelerini lazere maruz bırakmadan aynı koşullara tabi tutun.
2. Nörolojik şiddet skoru (NSS)
- Lazerin neden olduğu beyin hasarından 24 saat sonra nörolojik şiddet skorunu 43 puanlık bir skor kullanarak değerlendirin. Hayvanları nörolojik eksiklikler, davranış bozuklukları, ışın dengeleme görevi ve refleksler için test edin ve daha ciddi sakatlıklar için daha yüksek puanlar verin.
3. Beyin hasarının değerlendirilmesi
- Kan-beyin bariyeri (BBB) kırılmasının derecesinin belirlenmesi
NOT: Lazerin neden olduğu beyin hasarından 24 saat sonra BBB kırılmasını aşağıdaki gibi değerlendirin:- {{}} 4 mL / kg salin solüsyonu ile karıştırılmış %2 Evans Blue'yu sıçanlara intravenöz olarak uygulayın. kanüllü kuyruk damarı ve çözeltinin 1 saat boyunca dolaşmasına izin verin.
- Sıçanları %20 oksijen ve %80 CO2 (ilham yoluyla) maruz bırakarak ötenazi yapın son NSS'den 24 saat sonra.
- İntravasküler lokalize boyayı aşağıdaki gibi hasat edin:
- Sıçanların göğüslerini cerrahi iğneler ve cerrahi makasla açın.
- Sağ atriyumdan renksiz bir perfüzyon sıvısı elde edene kadar hayvanları 110 mmHg kullanarak sol ventrikül yoluyla soğutulmuş% 0.9 salin ile perfüze edin.
- Beyinleri hasat edin ve rostro-kaudal olarak 2 mm'lik dilimler halinde dilimleyin.
- Yaralı ve yaralanmamış hemisferleri ayrı ayrı değerlendirmek için sol beyin dilimlerini sağ kısımlardan ayırın.
- Tartın, havan ve havan tokmağı kullanarak homojenize edin ve ardından beyin dokularını 24 saat boyunca %50 trikloroasetik asit içinde inkübe edin.
- Homojenize beyin dilimlerini 20 dakika boyunca 10.000 × g'de santrifüjleyin.
- Santrifüjlenmiş beyinden 1 mL süpernatantı 1.5 mL %96 etanol ile 1:3'te karıştırın ve kan-beyin bariyerini değerlendirin 620 nm uyarma dalga boyunda (10 nm bant genişliği) ve 680 nm emisyon dalga boyunda (10 nm bant genişliği) bir floresan dedektörü kullanılarak kırılma.
NOT: Her iki sıçan grubu da BBB parçalanmasını belirlemek için aynı protokole tabi tutulur.
