Endotel Hücrelerinde Sıkı Bağlantı Proteinlerinin ve Stres Liflerinin Floresan Lokalizasyonu

Özet

Kaynak: Alluri, H., et al. Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyonunu İncelemek İçin İn Vitro İskemi-Reperfüzyon Yaralanma Modeli Olarak Oksijen-Glikoz Yoksunluğu ve Reoksijenasyon. J. Vis. Uzm. (2015).

Video, sıçan beyni mikrovasküler endotel hücrelerinde (RBMEC'ler) sıkı bağlantı proteinlerinin ve stres liflerinin floresan lokalizasyonunu göstermektedir. Stresli tek tabakada, sıkı bağlantı proteinlerini etiketlemek için floresan etiketli antikorlar kullanılırken, florofor etiketli falloidin stres liflerini etiketler. Etiketli moleküller daha sonra konfokal mikroskopi ile görselleştirilir.

Protokol

1. Endotel Hücrelerinin Tohumlanması

1. Yetişkin Sprague Dawley sıçanlarından RBMEC'lerin birincil kültürlerini elde edin (veya ticari olarak elde edin).
2. RBMEC'leri, sıçan beyni endotel hücresi büyüme ortamını kullanarak 100 cm fibronektin (50 μg / ml) kaplı petri kaplarında yetiştirin. Birleşme noktasına ulaşılana kadar ortamı her iki günde bir değiştirin.
3. % 80-90 birleşme noktasına ulaşıldığında, hücreleri 5 ml fosfat tamponlu salin (PBS) içinde döndürerek nazikçe yıkayın. Hücreler daha sonra 37 °C'ye dengelenmiş, 1 ml ılık %0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisine maruz bırakılarak ayrılır.
4. Hücreleri 37 ° C'de 2-5 dakika, hücreler ayrılıp dağılana kadar inkübe edin.
   NOTE: Hücreleri ayırmak için kültür kabına dokunun. Hücrelerin yemeğin yüzeyinden tamamen ayrıldığını doğrulamak için hücreleri mikroskop altında görüntüleyin.
5. Tripsini nötralize etmek için petri kabına 5 ml tam ortam ekleyin. Ayrılmış hücreler içeren ortamı pipetleyin ve 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne toplayın.
6. Endotel hücreleri içeren ortamı 5 dakika boyunca 220 x g'da santrifüjleyin.
7. Süpernatanı aspire edin ve pelet içeren hücreleri koruyun. Peletleri pipet ile hafifçe yukarı ve aşağı karıştırarak 3-5 ml taze sıçan beyni endotel hücresi büyüme ortamına süspanse edin. Hücreler daha sonra otomatik hücre sayacı veya bir hemositometre kullanılarak sayılacaktır.
8. Hücre süspansiyonunu fibronektin (50 μg/ml) içine aktarın, önceden kaplanmış 8 kuyulu steril hazneli slayt sistemi, 0,7 cm²/kuyu. Birleşme sağlanana kadar hücreleri 37 °C'de büyütün
   NOTE: Western lekeleri veya diğer deneyler yapmak için hücreler, deneyin gerektirdiği şekilde 10 cm'lik hücre kültürü kaplarında veya özel kaplarda büyütülebilir.

2. Oksijen ve Glukoz Yoksunluğu-Reoksijenasyon (OGD-R) In Vitro Model

1. OGD-R'nin RBMEC'ler üzerindeki etkilerini incelemek için hipoksi hücre kültürü sistemini kullanın (bkz. Şekil 1). Deneye başlamadan önce hipoksi hücre kültürü sistemini üreticinin talimatlarına göre kurun ve kalibre edin.
2. Birleşen hazne kızaklarını (adım 1.8) 37 °C inkübatörden çıkarın. Hazne slaytındaki tüm ortamı oksijeni alınmış, glikozsuz, Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile değiştirin ve %95 ile hipoksi odasına yerleştirin, N₂ and 5% CO₂.
3. Hücreleri %95 ile kuluçka makinesine geri taşıyın O₂, %5 CO₂ ve taze sıçan beyin endotel hücresi tam ortamı ile sağlanır ve 37 ° C'de 1 saat daha inkübe edilir.
   NOTE: Bu adım bir yeniden oksijenlenme durumunu temsil eder.
4. İmmünofloresan lokalizasyonu ve rodamin phalloidin etiketlemesi için hazne slaytlarını kullanın (bkz. bölüm 3).

3. Zonula occludens-1 (ZO-1) ve filamentli aktinin immünofloresan lokalizasyonu (f-actin) Rhodamine Phalloidin Kullanarak Etiketleme

1. RBMEC tek katmanları içeren hazne slaytlarını 100 μl opti-MEM/indirgenmiş serum ortamına/kuyuya 1 saat boyunca maruz bırakın. Hazne slaytlarını 100 μl fosfat tamponlu salin (PBS, pH 7.0-7.2) içinde 3 kez yıkayın.
2. Hücreleri PBS'de (pH 7.0-7.2) 100 μl% 4 paraformaldehit kullanarak 15 dakika sabitleyin ve hazne slaytlarını PBS'de (pH 7.0-7.2) 3 kez daha yıkayın.
3. PBS'de 100 μl% 0.5 Triton X-100, (pH 7.0-7.2) kullanarak hücreleri 15 dakika daha geçirgen hale getirin. PBS'de bir saat boyunca 100 μl% 2 sığır serum albümini (BSA) ile bloklayın. Bu adımdan sonra, hücreleri ZO-1 veya f-actin.
   1. İmmünofloresan boyama için hücreleri, 4 °C'de gece boyunca (O/N) %2 BSA-PBS'de hazırlanan, 1:150'de ZO-1'e karşı bir anti-tavşan birincil antikoru ile inkübe edin. Hücreleri PBS'de (pH 7.0-7.2) 3 kez yıkayın. 100 μl Floresein izotiyosiyanat (FITC) etiketli anti-tavşan ikincil antikoru ile oda sıcaklığında (RT) 1 saat inkübe edin.
   2. Rhodamine Phalloidin etiketlemesi için, bloklamayı takiben, hücreleri 20 dakika boyunca% 2 BSA-PBS'de hazırlanan 1: 50 seyreltmede 100 μl rodamin phalloidine maruz bırakın.
   3. Hücreleri PBS'de (pH 7.0-7.2) immünofloresan boyama ve rodamin phalloidin etiketlemesinden yıkayın. 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ile solma önleyici reaktif içeren montaj ortamını kullanarak odaları monte edin.
4. Hücreleri 60 X suya daldırma lensi kullanarak görselleştirin ve hücreler konfokal mikroskop altında tek bir optik düzlemde taranır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Proox model 110	Biospherix	Model 110
DMEM, glikoz yok	Gibco, Yaşam teknolojileri	11966-025
Rhodamine Phalloidin	Life technologies	R415
ZO-1 Tavşan Poliklonal Antikoru	Yaşam teknolojileri	617300
Nunc Lab Tek II-CC 8 iyi steril, cam kaydıraklar	Termo bilimsel	177402
FITC etiketli tavşan önleyici ikincil antikor	Santa cruz	sc-2090
DPBS 1X	Thermo scientific	SH 30028.03	diğer PBS kullanılabilir

Mevcut