Nöral kök hücre aktivasyonu ve göçünü incelemek için minimal bir omurilik yaralanması modeli

Özet

Kaynak: Lakshman, N., et al. Minimal Omurilik Yaralanması Fare Modelinde Endojen Nöral Kök Hücre Aktivasyonunu Değerlendirmek İçin Bir Nörosfer Testi. J. Vis. Uzm. (2018).

Bu video, bir fare omurilik yaralanması modelinde nöral kök hücrelerin (NSC'ler) aktivasyonunu ve göçünü göstermektedir. Omuriliği ortaya çıkarmak için, anestezi uygulanmış bir fareden omurganın torasik bölgesinden bir omur çıkarılır. Daha sonra omuriliğin beyaz maddesinde, merkezi kanalı koruyan bükülmüş bir iğne kullanılarak yüzeysel bir yaralanma oluşturulur. Yaralanmayı takiben, kanalı çevreleyen NSC'ler aktive edilir ve doku onarımına yardımcı olmak için yaralanma bölgesine göç eder.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Minimal Spinal Cord Yaralanması Cerrahisi

NOT: Ameliyattan önce tüm cerrahi alet ve malzemelerin uygun yöntemlerle sterilize edildiğinden emin olun (Şekil 1A).

1. Sabit bir gazlı bez rulosu elde etmek için 4-5 kare gazlı bezi yuvarlayarak ve ortada birbirine bantlayarak torasik bir destek kemeri oluşturun.
2. Fareyi indüksiyon odasına yerleştirin ve %5 izofluran ile anesteziyi başlatın. Devam etmeden önce ve prosedür boyunca ayak parmağı kıstırma refleksinin olmadığını onaylayın. Ameliyatın tamamlanması 30 dakikadan fazla sürebileceğinden, minimum izofluran maruziyeti için optimize edin (% 5'te 5 dakika ve% 2-3'te kalan süre).
3. Fareyi %2-3 izofluran idame dozunda anestezik makineye bağlı bir burun konisine aktarın. Ameliyat için geniş bir dikdörtgen cilt alanını ortaya çıkarmak için hayvanın sırtından sırtın ortasından boynuna / kulaklarına kadar kürkü çıkarmak için saç kesme makineleri kullanın.
4. Fareyi, burnunu takılı burun konisine yerleştirerek ve kafatasını kulak çubuklarıyla sabitleyerek stereotaksik bir alete aktarın. Kulak çubuklarının yerleştirilmesi sırasında izofluranı %5'te tutun ve fare stereotaksik cihaza sabitlendikten sonra %2-3'e kadar indirin.
5. Preoperatif analjezik ilaçları intraperitoneal olarak uygulayın — Meloksikam (2.0 mg / kg). Anestezi altındayken kornea kurumasını önlemek için açık fare gözlerine cömertçe göz kayganlığı uygulayın.
6. Kuyruğun tabanını hafifçe çekerek fare gövdesini ve omurgasını düzleştirirken torasik destek kemerini fare karnının altına yerleştirin. Kuyruğu ve tüm uzatılmış uzuvları yıldız benzeri bir konumda sabitlemek için laboratuvar etiketleme bandı kullanın. Sabitlendikten sonra, torasik omurgayı desteklemek için torasik destek kemerini fare karnından üst toraksa doğru rostral olarak itin (Şekil 1B).
7. Adım 1.3'te hazırlanan kürklü deri bölgesini %70 etanol ve ardından povidon-iyot ile dezenfekte ederek steril bir cerrahi alan hazırlayın. İki kez tekrarlayın. Geniş bir steril alanı korumak için steril bir cerrahi örtü uygulayın.
8. Bir #10 neşter bıçağı kullanarak, her iki kürek kemiğinin orta noktasından torasik omurganın eğriliğine kadar hayvanın uzunlamasına eksenine paralel dikey bir kesi yapın. Yumuşak dokuyu ve omurga konturunu ortaya çıkarmak için cildi geri çekin (Şekil 1C).
9. Supraskapular yağ yastığının alt sınırını belirleyin (bu, T4/5 vertebral seviyesini sınırlar). Aynı # 10 bıçakla, dikkatlice ama kuvvetle, sırt kası tendonlarını kolondan ayırmak için omur kemiği T5–T8 / 9'un her iki tarafını kesin.
10. Ekartörlerin dişlerini omurganın her iki yanındaki kesi bölgelerine yerleştirin. Geri çekilmiş kas katmanlarına çok fazla baskı uygulamadan omurgayı yeterince yükseltmek için ekartörleri genişleterek pozlamayı ayarlayın (Şekil 1D).
11. Cerrahi mikroskop altında, omurganın üzerindeki artık kasları ve diğer yumuşak dokuları dikkatlice temizleyin ve omur kemiğini ortaya çıkarın (Şekil 1E). Omurların dikenli sürecini dişli forseps ile sıkıştırarak ve hafifçe yukarı ve aşağı hareket ettirerek çıkarılacak omurları belirleyin.
    NOT: Bu, intervertebral eklemlerin tanımlanmasına izin vermeli ve ilgilenilen omurların altındaki küçük açıklıkları (intervertebral foramina) ortaya çıkarmalıdır.
12. Kavisli köreltilmiş makasın bir başını, açıkta kalan intervertebral foramenin her iki tarafına, eksize edilecek vertebral laminaya kaudal olarak yerleştirin ve bağlantı intervertebral eklemlerini iki taraflı olarak kesin.
13. Laminayı yukarı kaldırın ve kemiği izole etmek ve çıkarmak için laminanın üst ekini kesin.
    NOT: Bu, omuriliği içeren sağlam dural keseyi ortaya çıkaracaktır (Şekil 1F). Etkilenen bölgelere önceden kesilmiş 1 cm x 1 cm gazlı bez yerleştirilerek ve/veya steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkanarak kontrol edilebilen aşırı kanama olabilir.
14. Dorsal orta hat veni bir dönüm noktası görevi görürken, 30 G'lik bir iğne ucunun (iğne eğimi yukarı bakacak şekilde) 45° bükülmüş bir şaftını omuriliğin dorsolateral yüzeyine (yaklaşık 1 mm derinliğinde) orta hattın her iki tarafına yaklaşık 0,5 mm yanal olarak yerleştirin.
15. İğneyi kaudaldan rostral'a (orta hatta paralel) ~2 mm hareket ettirin, böylece iğnenin eğiminin tüm uzunluğu kordona sokulur. Giriş yolu üzerinden geri çekerek iğneyi çıkarın (Şekil 1G).
    NOT: Kanama olmaması gerekir ancak bu aşamada omurga dokusunda şişlik görülebilir.
16. Yarayı kapatmak için ekartörü çıkarın ve 6-0 emilebilir bir sütür kullanarak yaralanmanın her iki yanındaki sırt kaslarını orta hatta birlikte dikin. Daha sonra üstteki cildi kapatmak için 4-0 steril ipek sütür kullanın.

Sonuçlar

Şekil 1: Cerrahi Prosedür. (A) Gerekli her şeyin düzeni, referans için numaralandırılmıştır. (B) Düzleştirilmiş bir gövdeye, omurgaya ve uzuvlara yayılmış ve altına yerleştirilmiş torasik destek kemeri ile bantlanmış stereotaksik bir cihazdaki farenin resmi. (C) Kas tabakasını ve omurga konturunu açığa çıkaran dikey bir deri kesisi olan farenin resmi....

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Agricola Retractor	Fine Science Tools	17005-04
Moria Vannas-Wolff Yaylı Makas (Kavisli)	Fine Science Tools	15370-50	Körelmiş uçlar
Graefe Foreps (Düz, 1x2 Diş)	Fine Science Tools	11053-10
Ekstra İnce Graefe Forseps (Kavisli, Tırtıklı)	Fine Science Tools	11152-10	Veya dikiş
Hartman Hemostats (Straight)	Fine Science Tools	13002-10	Veya dikiş
Neşter Sapı #3	Fine Science Tools	10003-12	Veya başka bir uygun
Hair clippers	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Wahl-Professional-8685-Classic-Clipper/dp/B00011K2BA	veya başka bir uygun
Stereotaxic instrument	Stoeling	51500	veya başka bir uygun
Meloxicam			veya hayvan bakım tesisi
Tears Naturale P.M.	Alcon	https://www.amazon.ca/Alcon-Tear-Gel-Liquid-Eye-Gel/dp/B00HHXGUXE	veya başka bir uygun
Isoflurane	Baxter International Inc	DIN 02225875	veya anestezi için uygun başka bir
Q-ipuçları Cottom Swabs	amazon.ca	https://www.amazon.ca/Q-Tips-Cotton-Swabs-500-Count/dp/B003M5UO6U/ref=pd_lpo_vtph_194_bs_tr_img_1/140-7113119-8364127?_encoding=UTF8&psc=1&refRID=JC16N542KVRF2N62N3DS
Cotton Gaute	Fisher Scientific	13-761-52
30G İğneler	Becton Dickinson	305106	For Injury
25G Needles	Becton Dickinson	305122	İlaç enjeksiyonları
1mL Şırıngalar	Becton Dickinson	3090659	ilaç enjeksiyonları
3mL Syringes	Becton Dickinson	309657	for fluid injections
4-0 Suture	uoftmedstore.com	2297-VS881	for skin suturing
6-0 Suture	uoftmedstore.com	VS889	kas dikişleri
Standard Dissection Tools	Fine Science Tools
Diseksiyon Mikroskobu	Zeiss	Stemi 2000

almak için sipariş verirken özelleştirin için başka bir forsepsiçin uygun olan başka herhangi birtarafından onaylanan herhangi bir uygun şey için için için