İnsan Dışı Primat Beyin Dokusunda İmmünohistokimya Yapılması

Özet

Kaynak: Eid, L. & Parent, M. İmmünohistokimya ve Elektron Mikroskobu için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusunun Hazırlanması. J. Vis. Uzm. (2017).

Bu video, elektron mikroskobu için önceden gömme immünohistokimya kullanılarak aldehitle sabitlenmiş insan olmayan primat beyin dokusunun hazırlanmasını göstermektedir. Spesifik bir nöronal proteinin immüno-etiketleme adımlarını ana hatlarıyla belirtir, ardından renkli bir çökelti üreten bir peroksidaz reaksiyonu ile hedef proteinin elektron mikroskobunda görselleştirilmesini sağlar.

Protokol

Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.

1. Önceden gömme İmmünohistokimya (Şekil 1C)

1. Aşağıdaki gibi 4 L'lik bir Tris tamponlu Salin (TBS, 50 mM, pH 7.6) stok çözeltisi hazırlayın.
   1. 4 L'lik bir beherde 2L damıtılmış su ölçün, 24.23 g trihidroksimetil aminometan (THAM; C₄H₁₁NO₃) ve çözünmesi için karıştırın.
   2. Yaklaşık 148 mL 1 N HCl ile pH'ı 7,6'ya ayarlayın. 7.6'nın altında bir pH'a ulaşmamak için asit dikkatli bir şekilde eklenmelidir. Toplam hacim 4 L olmalıdır.
      DİKKAT: HCl oldukça aşındırıcıdır. Uygun KKD'yi giyin.
2. EM immünohistokimya için işlenecek ilgi bölgesini içeren bölümleri seçin.
3. Antifriz solüsyonunu durulamak için serbest yüzen bölümleri PBS'de (0,1 M, pH 7,4) RT'de 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
4. PBS'de seyreltilmiş %0,5'lik bir NaBH₄ çözeltisi hazırlayın.
   1. 0,05 g NaBH₄ tartın ve 10 mL PBS ile seyreltin. Üzerini örtme. Bu çözeltiyi kullanmadan hemen önce hazırlayın.
5. Bölümleri taze hazırlanmış NaBH₄ solüsyonunda RT'de 30 dakika inkübe edin. Yavaşça sallayın. Üzerini örtme.
6. RT'de 10 dakika boyunca PBS'de 3x'i yıkayın, reaksiyon gazının hiçbiri kalmayana kadar kuvvetlice sallayın.
7. PBS'de seyreltilmiş %2 uygun normal serum ve %0,5 soğuk balık jelatini ile EM için bir bloke edici solüsyon hazırlayın.
   NOT: Miktar, aşağıdaki üç adıma yetecek şekilde hesaplanmalıdır. İkincil antikoru barındıran aynı hayvan türünden yapılmış bir serum kullanın. Antijen alma yöntemlerinin kullanılmasından veya az miktarda triton eklenmesinden (antikorların penetrasyonunu artırmak için) kaçının, çünkü bu yöntemler dokunun kalitesini önemli ölçüde tehlikeye atar.
8. Blokaj solüsyonundaki bölümleri RT'de 1 saat inkübe edin.
9. Bloke edici solüsyonda seyreltilmiş primer antikor solüsyonunu hazırlayın.
   NOT: Primer antikorun konsantrasyonu genellikle LM immünohistokimyasınınkiyle aynıdır, ancak bazı primer antikorlar akrolein ile çalışmayabileceğinden, önceden farklı antikor konsantrasyonlarıyla testler yapmayı düşünün. Eğer öyleyse, transkardiyak perfüzyon için glutaraldehit (%0.1 - 2) ve %4 PFA karışımı kullanmak ve benzer sonuçlar elde etmek mümkündür. Kuluçka süresini ve sıcaklığını da optimize edin.
10. Primer antikor solüsyonundaki bölümleri gece boyunca RT'de hafif sallama ile inkübe edin. Önceden test edilmiş bir inkübasyon süresi ve sıcaklığı kullanın.
11. Bölümleri PBS'de 3x RT'de 5 dakika boyunca hafifçe sallayarak yıkayın.
12. Bloke edici solüsyonda seyreltilmiş 1:1.000'lik bir biyotinillenmiş ikincil antikor solüsyonu hazırlayın.
    NOT: İkincil antikor, birincil antikoru oluşturmak için kullanılan konakçı türe karşı yükseltilmelidir.
13. Bölümleri RT'de 1,5 saat boyunca ikincil bir antikor solüsyonunda inkübe edin. Yavaşça sallayın.
14. İkincil antikor inkübasyonunun bitiminden en az 60 dakika önce bir avidin-biotin-peroksidaz (ABC) çözeltisi hazırlayın.
    1. 8,80 μL/mL A ve B çözeltilerini ölçmek için kalibre edilmiş bir pipet kullanın ve bunları PBS'de seyreltin.
    2. Avidin ve biotin molekülleri arasındaki tam bağlanmayı sağlamak için RT'de en az 60 dakika hafifçe sallayın.
15. İkincil antikor solüsyonunda inkübasyondan sonra, RT'de 10 dakika boyunca PBS'de 3x'i yıkayın.
16. ABC solüsyonundaki bölümleri RT'de 1 saat inkübe edin. Yavaşça sallayın.
17. RT'de 10 dakika boyunca PBS'de bir kez ve TBS'de iki kez hafifçe sallayarak yıkayın.
TBS'de seyreltilmiş %0.005_H2O2ile %0.05 3,3'-diaminobenzidin (DAB) içeren taze bir çözelti hazırlayın.
18. 1. 12.5 mg DAB tartın ve 25 mL soğuk TBS ile seyreltin. Işıktan koruyun.
       DİKKAT: DAB tozu oldukça uçucudur ve solunduğunda zararlıdır. Kanserojen ve teratojeniktir. Bu nedenle, hamile veya emziren kadınlar seyreltilmiş olsa bile bu ürünü manipüle etmemelidir. Manipüle ederken bir N95 maskesi kullanın ve KKD giyin.
    2. Solüsyonu filtreleyin ve kullanmadan hemen önce 4,5 μL %30_H2O2ekleyin.
19. DAB solüsyonunda bölümleri RT'de 3 ila 7 dakika inkübe edin.
    NOT: Yüksek düzeyde arka plan lekelenmesini önlemek için kahverengi çökelti çok koyu olmamalıdır. Kuluçka süresi buna göre optimize edilmelidir.
20. Soğuk TBS'de iki kez, ardından RT'de soğuk TBS'de 10 dakika boyunca iki kez, ardından PB'de 10 dakika boyunca iki kez hafif sallanma ile hızlı bir şekilde yıkayarak reaksiyonu durdurun.
    NOT: PB (PBS değil) kullanımı, osmiyum ile reaksiyona gireceği ve kristaller oluşturacağı için NaCl izlerini ortadan kaldırmak için kritik öneme sahiptir.

Sonuçlar

Şekil 1: Protokolün temel adımlarının şemaları. Maymun beyni (A) bir soğutma vibratomu (B) ile seri bölümlere ayrılır. Daha sonra immünohistokimya ve elektron mi...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dibazik susuz sodyum fosfat	Fisher scientific	S374-500	<
Monobazik monohidrat sodyum fosfat	EM Science	SX0710-1
Sodyum klorür (NaCl)	Fisher scientific	S271-3
Hydroxymethyl aminometan (THAM)	Fisher scientific	T370-500
HCl	EMD	HX0603-3	1N seyreltme. Ürün aşındırıcıdır. Uygun poteksiyon ile kullanın.
NaOH	EMD	SX0590-1	5N seyreltme. Ürün aşındırıcıdır. Uygun koruma ile kullanın.
Paraformaldehit	Sigma	P6148	4% seyreltme. Ürün toz halinde oldukça uçucudur ve oldukça toksiktir. Uygun korumaya sahip bir havalandırma başlığı altında dikkatli kullanın.
Acrolein (%90)	sigma	110221	3% seyreltme. Ürün oldukça zehirlidir. Uygun korumaya sahip bir havalandırma başlığının altında kullanın.
otopsi havalandırma masası	Mopec	CE400
elektronik perfüzyon pompası	cole parmer	masterflex L/S 7523-90
Needle (perfusion)	terumo	NN-1838R	18G 1 1/2
Needle	terumo	NN-2713R	21G 1/2
Ketamin			20 mg/kg
Xylazine			4 mg/kg
Acepromazine			0.5 mg/kg
Scalpel
Scalpel blades	Tüy mızrak	201011 J9913	Ameliyat için No.22 ve EM
Surgical scissors
Rongeurs			<
Vibratome	Leica	VT 1200S	Cihaz izin verdiğinde bıçağı her kullanımdan önce kalibre edin
Vibratome razor blade	Gillette	GIN 642107
Glycerol	Fisher scientific	G33-4	%30 seyreltme
Etilen glikol	Fisher scientific	E178-4	%30 seyreltme
Sodium borohydride	sigma	S-9125
Normal at serumu	Jackson immunoResearch Laboratories	008-000-121	2% seyreltme
Soğuk balık jelatini	Aurion	900.033	0.5 seyreltme. Orijinal ürün %40'ta yoğunlaşmıştır<
Primary antikor, SERT	Santa Cruz biyoteknolojisi	SC-1458	1/500 dilution
Primary antikor, ChAT	Chemicon (Millipore)	AB144P	1/25 seyreltme
Primary antikor, TH	ImmunoStar	22941	1/1000 dilution
biyotinile edilmiş ikincil antikor, keçi	Vector laboratories	BA-9500	1/1000 seyreltme
	BA-2000	1/1000 dilution
Vectastain elite ABC kit	Vector laboratories	PK6100	8,8 μL/mL A ve B'nin her
3'3 diaminobenzidin (DAB)	Sigma	D5637	0,05% seyreltme. Ürün toz halinde oldukça uçucu ve toksiktir. Lavaboya atık atmayın.
peroxide 30%	Fisher scientific	H-323	0,005% seyreltme

tr style='height:19px;' >='height:19px;' >tr style='height:19px;'>tr style='height:19px;'>border-bottom:1px solid #000000;border-right:1px solid #000000;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:top;'>Vector laboratories biri