$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan örneklerini içeren tüm prosedürler, uygun hayvan etik inceleme komitesi tarafından gözden geçirilmiş ve onaylanmıştır.
- Doku Boyama
- Işık geçirmez bir boyama kutusunda, deiyonize su ile ıslatılmış tüy bırakmayan dokularla bir "nem odası" oluşturun.
- Slaytın kenarlarını tüy bırakmayan bir mendille kurulayın, slaytın en kenarında, doku bölümlerinden uzakta sıvı itici bir kenarlık yapmak için mini bir pap kalem kullanın. Bu sınır, sıvının menisküsü ile dokunun kenarı arasında geniş bir boşluk sağlamalıdır, böylece yüzey gerilimi lekelenmeyi etkilemez.
NOT: Pap kalem itici sınır, ilgilenilen antikorlar mikrodalga antijen alımı gerektirmiyorsa 1.1.3'ten önce uygulanabilir. Pap kalem PBS'de yıkamadan önce uygulanmışsa, bu adımda sıvı itici kenarlığın bütünlüğü kontrol edilmelidir. Kenarlıktaki boşlukları doldurmak için bir mini-pap kalem kullanın. - Slaytlar yatay olarak yerleştirildiğinde, PBS'de% 4 v / v serumda (blok çözelti) inkübe ederek spesifik olmayan antijen bağlanmasını bloke edin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca slayt başına 300 μl blok solüsyonu pipetleyin. Doku yakınındaki yüzey geriliminin neden olduğu düzensiz lekelenmeyi önlemek için blok solüsyonun sürgünün kenarındaki pap kaleme kadar uzandığından ve dokuyu tamamen kapladığından emin olun.
- İkincil antikorun yapıldığı aynı türden serum kullanın. Not: Bu prosedürde, ikincil antikorlar eşekte yapılır ve bu nedenle eşek serumu kullanılır. İki veya daha fazla farklı türden ikincil antikorlar kullanılıyorsa, her türden serum ekleyin.
- Birincil antikoru slaytlara pipetleyin. Not: Bu boyama için antikor konsantrasyonları, Iba1 ve Pan-nöronal için sırasıyla 1: 5.000 ve 1: 500'de optimize edilmiştir. Bu konsantrasyonların, arka plan boyaması olmadan anlamlı lekelenme gösterdiği bulunmuştur.
- Blok çözeltisini PBS'de% 1 seruma seyreltin ve birincil antikorlar ekleyin. Slayt başına% 1 serumda 300 μl primer antikor çözeltisi pipetleyin. Yine, sıvının pap kalemin kenarına kadar geldiğinden emin olun. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
- Üç kontrol slaytı ekleyin: biri ne Iba1 ne de Pan-nöronal antikorlar içeren, biri Pan-nöronal antikoru olmayan Iba1 ile ve diğeri Iba1 içermeyen Pan-nöronal antikorlu. Bu slaytları aynı çalışmada aynı çözeltilerle boyayın, ancak ikincil antikorların spesifik olmayan bağlanmasını test etmek için birincil antikorları atlayın.
- Ertesi sabah, her biri 5 dakika boyunca PBS'de üç kez yıkayın ve yıkamalar arasındaki solüsyonu değiştirin.
- Floresan antikorlar ışığa duyarlıdır, bu nedenle, bu adımdan itibaren, yıkama kaplarının folyoya sarılmasını ve hibridizasyon kutularının siyah olmasını veya karanlıkta inkübe edilmesini sağlayarak ışığa maruz kalmayı en aza indirin. Uygun ikincil antikorları tüm slaytlara pipetleyin ve oda sıcaklığında 1:250 konsantrasyonda blok çözeltide (bkz. adım 1.2.3) ışık geçirmez bir "nem odasında" (bkz. adım 1.2.1) 60 dakika inkübe edin.
- Farklı dalga boylarında ikincil antikorlar kullanın. Burada, birincil antikor tavşan anti-Iba1 için, uygun ikincil antikor olarak eşek anti-tavşan 594 kullanın. Birincil antikor fare anti-Pan-nöronal için, uygun ikincil antikor olarak eşek anti-fare 488 kullanın. Alternatif olarak, anti-tavşan 488 ve anti-fare 594 kullanın.
- Slaytları PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- İsteğe bağlı: nükleer boyama yapın.
- Çift damıtılmış H2O'da 0.03 μg/ml konsantrasyonda Hoechst'e (veya başka bir nükleer boyaya) tam olarak 60 saniye boyunca yerleştirin.
- Slaytları PBS'de her biri 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- ddH2O.
- Yer kayması
- Fluoromount-G veya ProlongGold gibi sulu bir montaj ortamına sahip lamel slaytları. Pamuk uçlu bir aplikatör kullanarak tüm baloncukları çıkarmaya özen gösterin.
Not: Diğer montaj maddeleri de kullanılabilir, ancak boyalar arasında yüksek kanama olması, bazıları tarafından kaymadan sonraki günler içinde kaydedilmiştir. - Kenarları kapatmak için şeffaf oje kullanın, buharlaşma nedeniyle bölümlerin kurumasını önleyin. Slaytlar düz ve oda sıcaklığında kalırken ojenin ışık geçirmez bir kapta kurumasına izin verin ve ardından 4 °C'de folyoya sarılmış hafif geçirmez bir kapta saklayın.