Beyin Tümörü Nörosfer Kesitlerinde Biyobelirteçlerin İmmünohistokimyasal Boyanması

Özet

Kaynak: Núñez, F. J., et al. Parafin Gömülü 3D Glioma Nörosfer Kültürlerinde İmmünohistokimya ile Gliomdaki Biyobelirteçlerin Değerlendirilmesi. J. Vis. Uzm. (2019).

Bu video, parafine gömülü beyin tümörü nörosferlerinde tümör biyobelirteçlerini etiketlemek için immünohistokimyasal bir tekniği göstermektedir. Nörosfer bölümleri parafin uzaklaştırma ve rehidrasyona tabi tutulur, ardından biyobelirteç bölgelerini ortaya çıkarmak için tedavi uygulanır. Birincil ve ikincil antikorlar daha sonra bu biyobelirteçleri etiketlemek için uygulanır. İkincil antikorlar, biyobelirteç konumlarını belirtmek için kromojenik substratları oksitleyen avidin konjuge peroksidaz enzimleri tarafından bağlanır. Son olarak, mikroskobik analiz için nükleer karşı boyama ve lam hazırlama işlemleri tamamlanır.

Protokol

1. Parafine gömülü nörosferlerin (NS) immünohistokimyası (IHC)

1. Slaytları metal bir rafa yerleştirerek ve 60 °C'de 20 dakika inkübe ederek parafini eritin.
2. Oda sıcaklığında (RT) bir rehidrasyon treninde inkübe ederek slaytları deparafinize edin: 5 dakika boyunca 3x ksilen, 2 dakika boyunca %100 2x etanol, 2 dakika boyunca %95 2x etanol, 2 dakika boyunca %70 1x etanol ve 2 dakika boyunca 1x deiyonize su. Bunun üzerine, antijen alınana kadar slaytları musluk suyunda tutun, çünkü kuruması spesifik olmayan antikor bağlanmasına neden olacaktır.
3. Slaytları sitrat tamponunda (10 mM sitrik asit, %0.05 iyonik olmayan deterjan, pH 6) 125 °C'de 30 saniye ve 90 °C'de 10 saniye inkübe edin. Soğumalarını bekleyin, ardından slaytları 5 kez damıtılmış suyla durulayın.
4. Slaytları RT'de %0,3 H₂O₂ 30 dakika boyunca inkübe edin.
5. {{}} Slaytları 3 kez yıkama tamponunda (Tris tamponlu tuzlu su [TBS] içinde% 0.025 deterjan) 5 dakika boyunca hafif çalkalama ile yıkayın.
6. Slaytları RT'de bloke edici solüsyon (TBS'de% 10 at serumu,% 0.1 sığır serum albümini [BSA]) ile 30 dakika inkübe edin.
7. Slaytları, seyreltme çözeltisinde hazırlanan birincil antikor (TBS'de% 0.1 BSA) ile nemlendirilmiş bir odada 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Slaytları 3 kez yıkama tamponunda 5 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
8. Slaytları, seyreltme çözeltisinde hazırlanan biyotinile edilmiş bir ikincil antikor ile RT'de 1 saat inkübe edin. Slaytları 3 kez yıkama tamponunda 5 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
9. Slaytları karanlıkta RT'de avidin-biyotinile yaban turpu peroksidaz kompleksi ile 30 dakika inkübe edin. Slaytları 3 kez yıkama tamponunda 5 dakika boyunca hafif çalkalayarak yıkayın.
10. Slaytları 3,3'-Diaminobenzidin (DAB)-H₂O₂ substrat markaları ile RT'de 2-5 dakika inkübe edin.
11. Musluk suyuyla 3 kez durulayın. Slaytları lekelemek için hematoksilen solüsyonuna batırın (1-2 sn), ardından berraklaşana kadar musluk suyunda iyice durulayın.
12. Slaytları şu şekilde kurutun: damıtılmış suda 2 dakika inkübe edin, 3 kez% 80 etanole batırın,% 95 etanolde 2 kez% 2 kez inkübe edin, her biri% 100 etanolde 2 kez 2 dakika inkübe edin ve son olarak her biri 3 dakika boyunca 3 kez ksilen içinde inkübe edin.
13. Slaytları ksilen bazlı bir montaj ortamı ile örtün ve görüntüleme için hazır olana kadar RT'de düz bir yüzeyde kurumaya bırakın.

NOT: DAB boyama yapılıyorsa, slaytlar RT'de saklanabilir. Bununla birlikte, immünofloresan boyama yapılırsa, foto-ağartmayı azaltmak için slaytlar karanlıkta -20 °C'de saklanmalıdır.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Tavşan poliklonal anti-ATRX,	Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-15408	IHC, 1:250 seyreltme
Tavşan poliklonal anti-Ki-67	Abcam	Ab15580	IHC, 1:1000 seyreltme
Tavşan poliklonal anti-OLIG2	Millipore	{{}}AB9610	IHC, 1:500 seyreltme
Keçi poliklonal anti-tavşan biyotin konjuge	Dako	E0432	IHC, 1:1000 seyreltme
Vectastain Elite ABC HRP kiti	Vector Laboratories Inc	PK-6100
BETAZOID DAB CHROMOGEN KIT{{TAG_ 61}}	Biocare medical	BDB2004 L/price till 12/18