Mikro Bilgisayarlı Tomografi Görüntüleme Kullanılarak Bir Farede Serebral Trombüsün Görselleştirilmesi

Özet

Kaynak: Kim, D., et. al. Serebral Tromboemboliyi Doğrudan Görselleştirmek için Yakın Kızılötesi Floresan Görüntüleme ve Mikro Bilgisayarlı Tomografi. J. Vis. Uzm. (2016)

Bu video, mikro bilgisayarlı tomografi (mikro-BT) görüntüleme kullanılarak farelerde serebral trombüsün görselleştirilmesini göstermektedir. Bir serebral trombüs fare modeline, kontrast bir ajan olarak işlev gören fibrin hedefli altın nanopartiküller enjekte edilir. Fare, bir mikro-CT makinesinin yatağına yerleştirilir ve görüntüler birden fazla açıdan elde edilir. Uygun yazılım kullanılarak görüntüler yeniden oluşturulur ve işlenir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Floresan İşaretleyici ile Etiketlenmiş Dışsal Olarak Oluşturulmuş Pıhtının Hazırlanması (Şekil 1)

1. % 30 oksijen (1.5 L / dak,% 100 oksijen) ile karıştırılmış %3 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında bir fareyi uyuşturun. Kas tonusunu gözlemleyerek ve ayak parmağını sıkıştırma refleksinin olmadığını doğrulayarak yeterli anestezi derinliğini sağlayın.
2. Hayvanı yüzüstü pozisyonda steril bir örtü üzerine yerleştirin ve bir inhalasyon maskesi ve% 30 oksijen ile karıştırılmış% 2 izofluran kullanarak anestezi altında tutun. Aseptik teknikler ve steril önlükler/maskeler/eldivenler/aletler kullanarak aşağıdaki prosedürleri gerçekleştirin. İşlemlerden önce ve sonra deney alanını %70 alkol ile temizleyerek ve sterilize ederek steril koşulları koruyun.
3. Kardiyak ponksiyondan sonra yaklaşık 300 ~ 1.000 μl arteriyel kan toplayın. 70 μl tam kanı, pıhtıyı floresan olarak işaretlemek için aktive faktör XIII (FXIIIa) pıhtılaşma enziminin fibrin çapraz bağlama aktivitesine duyarlı bir Cy5.5 floresan probu olan 30 μl C15 probu (20 μmol / L konsantrasyon) ile karıştırın (Şekil 1A). Karışık kanı 3 ml'lik bir şırınga (23 gauge iğne) kullanarak 20 cm uzunluğunda bir polietilen tüpe (PE-50, ID 0.58 mm) enjekte edin. PE tüpler sterilize edilmeli (veya üretici tarafından steril olarak sertifikalandırılmalıdır) ve pıhtılar bir doku kültürü başlığında aseptik olarak hazırlanmalıdır.
4. Solunum ve kalp nabzı eksikliğini gözlemleyerek hayvanın ölümünü doğrulayın.
5. Kan yüklü tüpü oda sıcaklığında 2 saat, ardından 4 °C'de 22 saat bırakın ve daha önce bildirildiği gibi aşağıdaki prosedürleri uygulayın.
6. Trombüs içeren tüpü 1,5 cm uzunluğunda parçalar halinde kesin. Fosfat tamponlu salin (PBS) ile doldurulmuş 3 ml'lik bir şırınga kullanarak, PBS'yi her bir tüp parçasına nazikçe enjekte ederek trombüsü PBS içeren 6 oyuklu bir plakaya boşaltın. Trombüsleri PBS ile üç kez yıkayın (Şekil 1B).
7. 15 cm uzunluğundaki PE-10 tüpünün (ID 0.28 mm) distal uç kısmını, yıkanmış trombüsü dikkatlice çizerek 1.5 cm uzunluğunda bir trombüs ile yükleyin, hava kabarcıklarından kaçınırken, tüpün proksimal ucuna yerleştirilen 30 gauge iğne ile salin dolgulu 1 ml'lik bir şırınga kullanın.
8. Trombüs yüklü PE-10 tüpünü, orta serebral arter (MCA) – iç karotis arterin (ICA) ön serebral arter (ACA) bifurkasyon alanına yerleştirilecek olan konik bir uca (ID 200 μm) sahip olacak şekilde modifiye edilmiş 3 cm uzunluğunda bir PE-50 tüpü (ID 0.58 mm) ile bağlayın.

2. Tromboembolik İnme Fare Modelinin Modellenmesi (Şekil 2)

1. %30 oksijen (1,5 L/dk) ile karıştırılmış %3 izofluran kullanarak bir indüksiyon odasında okşanacak farklı bir fareyi uyuşturun. Ameliyat sonrası ağrıyı hafifletmek için deri altına meloksikam (5 mg / kg) enjekte edin. Kas tonusunu gözlemleyerek ve ayak parmağını sıkıştırma refleksinin olmadığını doğrulayarak yeterli anestezi derinliğini sağlayın.
2. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için her göze az miktarda veteriner merhemi sürün. Aseptik teknikler ve steril önlükler/maskeler/eldivenler/aletler kullanarak aşağıdaki cerrahi prosedürleri gerçekleştirin. Ameliyat öncesinde, sırasında ve sonrasında cerrahi alanı %70 alkolle temizleyerek ve sterilize ederek steril koşulları koruyun.
3. Fareyi bir ameliyat masasına getirin. Hayvanı yüzüstü pozisyonda steril bir örtü üzerine yerleştirin ve bir inhalasyon maskesi ve% 2 izofluran kullanarak anestezi altında tutun. Ardından, rektal termometreden geri bildirim alan homeotermik bir battaniye kullanarak vücut sıcaklığını 36.5 ° C'de sıkıştırın.
4. Betadin ve %70 alkol ile cerrahi hazırlık yapıldıktan sonra sol kulak ile göz arasındaki saçlı deriye neşter kullanarak 1 cm'lik dikey bir kesi yapın. Bir lazer Doppler akış ölçerin optik fiberinin distal ucunu açıkta kalan sol temporal kemik yüzeyine (1 mm sol ve bregmanın 4 mm altında) yapıştırın. Ardından, Doppler akış izlemeyi başlatın (Şekil 2A).
5. Hayvanı yatır. Bir pime bağlı bir ip ile üst ön dişi çekerek boynu düzeltin ve boyun bölgesini tıraş edin. Daha sonra 3 cm'lik dikey bir orta hat kesisi yapın, açın ve peri-vasküler yumuşak dokuları diseke ederek sol karotis ampul alanını ortaya çıkarın. Vagus sinirine zarar vermemeye dikkat edin.
6. Sol proksimal ortak karotis arteri (CCA) steril 6-0 siyah ipek sütür kullanarak ve sol İKA ve sol pterygopalatin arteri (PPA) steril 7-0 siyah ipek sütürler kullanarak ligate edin.
7. Sol eksternal karotis arterin bir dalı olan sol superior tiroid arterini monopolar elektrikli koter kullanarak koterize edin ve sol proksimal eksternal karotid arteri (ECA) gevşek bir şekilde ve daha distal bölgeyi steril 7-0 siyah ipek dikişler kullanarak sıkıca bağlayın.
8. Bir mikro makas kullanarak, ECA'nın bağlanmış bölgeleri arasında küçük bir delik (yaklaşık 0.2 ~ 0.25 μm çapında) açın.
9. Proksimal ECA ligasyonunu gevşetirken trombüs içeren kateteri ECA'daki deliğe yerleştirin. Kateteri yerine oturtmak için kateteri CCA'ya ilerlettikten sonra proksimal ECA ligasyonunu tekrar sıkın.
10. Distal ligasyon bölgesinin distalinde olan ECA distal kısmını kesmek için koterize edin ve kateteri CCA'dan çekerken serbest proksimal ECA'yı İKA yönüne hizalamak için saat yönünde döndürün. Ardından, İKA ligasyonunu gevşettikten hemen sonra kateteri distal İKA'nın MCA-ACA bifurkasyon alanına yaklaşık 9 mm ilerletin. Ardından, ICA ligasyonunu sıkın.
11. Trombüsü enjekte etmek için şırıngaya 1 ml hafifçe bastırarak trombüsü bifurkasyon alanına yerleştirin. Trombüs damarı başarılı bir şekilde tıkadıysa, taban çizgisine kıyasla %30 veya daha düşük olması gereken Doppler serebral kan akışındaki (CBF) azalmayı kontrol edin (Şekil 2B).
12. Kateteri çıkarın ve ECA proksimal bölgesini hemen ve sıkı bir şekilde bağlayın. Ek olarak, CCA ve PPA'yı serbest bırakın.
13. Kesi bölgesini 6-0 ipek dikişler kullanarak kapatın. Gerekli bir süre boyunca Doppler izlemeye devam ettikten sonra anesteziyi durdurun (burada, trombüs enjeksiyonundan sonra 30 dakika boyunca). Fareyi boş bir kafese geri koyun ve bir ısıtma lambası ile sıcak tutun. Sternal yaslığı sürdürmek için yeterli bilinç kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın.

3. Serebral Trombüsün İn Vivo MikroBT Görüntülemesi (Şekil 3)

1. Trombüsün serebral artere yerleştirilmesi nedeniyle embolik inmenin başlamasını takiben önceden belirlenmiş bir zaman noktasında (burada 1 saat) adım 2.1'de tarif edildiği gibi% 2 izofluran ile fareyi yeniden uyuşturun. Ayak parmağını kıstırma refleksinin olmadığını doğrulayarak yeterli anestezi derinliğini sağlayın. Anestezi sırasında kuruluğu önlemek için her göze az miktarda veteriner merhemi sürün.
2. 10 mM PBS'de 10 mg Au / ml konsantrasyonda fibrin hedefli altın nanopartikülleri (fib-GC-AuNP4) yeniden süspanse edin ve nanopartiküllerin çözünmesini ve dağılmasını sağlamak için trombüs görüntüleme ajanını 30 dakika boyunca sonikasyon yapın. Penis damarına 300 μl fib-GC-AuNP (10 mg / ml) enjekte edin.
3. Hayvanı bir mikroCT makinesinin yatağına yerleştirin ve hareket artefaktlarını azaltmak için üst ön dişi bir pime bağlı bir ip ile çekerek boynu düzeltin.
4. Fib-GC-AuNP enjeksiyonundan 5 dakika sonra, beynin mikro-BT görüntülerini elde etmeye başlayın. Burada açıklanan deneyler için aşağıdaki görüntüleme parametrelerini kullanın: 65 kVp, 60 μA, 26,7 x 26,7 x 27,9 mm³ görüş alanı, 0,053 x 0,053 x 0,054 mm³ voksel boyutu, kare başına 100 milisaniye, bir ortalama, 360 görünüm, 512 x 512 rekonstrüksiyon matrisi, 600 dilim, 64 sn tarama süresi.
5. Fareyi boş bir kafese geri koyun ve bir ısıtma lambası ile sıcak tutun. Sternal yaslığı sürdürmek için yeterli bilinç kazanana kadar fareyi gözetimsiz bırakmayın.
6. Mikro-CT tarayıcıya kurulu bir yazılım paketindeki 'Yeniden Yapılandırma' panelinin 'Başlat' komutunu kullanarak ham görüntü verilerini Tıpta Dijital Görüntüleme ve İletişim (DICOM) formatına dönüştürün.
7. Görüntülerin nicel analizleri için (6. adımda), üreticinin talimatlarına göre piyasada bulunan bir yazılım paketini kullanarak DICOM verilerini TIFF formatına dönüştürün.
8. Kalitatif analizlerin yanı sıra daha basit ve daha hızlı bir şekilde kantitatif analizler için, aşağıdaki gibi 1 veya 2 mm (burada 2 mm) kalınlığa sahip olacak şekilde oluşturulmuş yeni bir eksenel ve koronal görüntü seti oluşturmak için yazılım paketini ve DICOM formatındaki orijinal 0,054 mm kalınlığındaki görüntüleri kullanın.
   1. 'Veri Kaynağı' ağacında DICOM klasörünü seçin, farenin sağ tuşuna tıklayın ve klasörü 'MasterDB' veya 'PrivateDB'ye aktarın.
   2. 'Veri Kaynağı' ağacında 'MasterDB' veya 'PrivateDB' öğesine tıklayın ve içe aktarılan klasörü seçin. En soldaki paneldeki '3D' sekmesine tıkladıktan sonra, 'Yükleme Seçenekleri' penceresi açıldığında, klasördeki bir dizi görüntüyü yığın olarak içe aktarmak için 'Tamam'a basın.
   3. Eksenel ve koronal görüntü pencerelerinde 'MRP' sözcüğünü tıklatarak ve açılır menüden 'MIP'yi seçerek görüntü gösterimini maksimum yoğunluk projeksiyonu (MIP) formatına değiştirin. Ardından, aynı pencerede 'TH : 0 [mm]' seçeneğine tıkladıktan sonra görüntü kalınlığını 2 mm olarak değiştirin.
   4. Bir görüntü yığınını keşfetmeye ve uygun bir açı ve konumda dilimlemeye olanak tanıyan 2 mm genişliğindeki 3D navigasyon çubuğunu kullanarak, trombüs barındıran Willis (COW) çemberinin tam kapsamını kapsayan 2 mm kalınlığında bir eksenel kesit görüntüsü hazırlayın. 'Çıktı' panelindeki yakalama düğmesine (kamera simgesi) tıklayın. Görüntüyü TIFF formatında kaydedin.
9. Ardından, frontal lobdan beyinciğe bitişik olarak uzanan 2 mm kalınlığında beş koronal kesit görüntüsü hazırlayın.
   1. İlk olarak, koronal görüntünün MCA-ACA trombüsünü en iyi şekilde görselleştirebilmesi için navigatör çubuğunu eksenel görüntü üzerinde dikkatlice hizalayarak ikinci dilimi hazırlayın.

Ardından, diğer dört dilimi bitişik bir şekilde hazırlayın. 'Çıktı' panelindeki yakalama düğmesine (kamera simgesi) tıklayın. Görüntüleri TIFF formatında kaydedin.

Sonuçlar

Şekil 1: Floresan etiketli kan pıhtısının hazırlanmasına genel bakış. (A) Pıhtı olgunlaşma süreci sırasında aktive edilmiş pıhtılaşma faktörü XIIIa'nın fibrin çapraz bağlama enzimatik etkisi ile trombüsün fibrin ipliklerine kovalent olarak b...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Machines
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Kore	NFR Polaris-G90
Lazer Doppler akış ölçer	Perimed, Stockholm, İsveç	PeriFlux Sistemi 5000
Cerrahi mikroskop	Leica Microsystems, Seul, Kore	EZ4HD
İnhalasyon anestezi makinesi	PerkinElmer, Massachusetts, ABD	XGI-8
Yazılımı
NFR kontrolü	NanoFocusRay, JeonJu, Kore	NFR Polaris-G90	microCT kontrol yazılımı
Lucion	Infinitt, Seul, Kore	Lucion	3D render görüntüleme yazılımı
Laboratuvar şeması 7	ADInstruments, Colorado, ABD	Laboratuvar şeması 7	rCBF
Image J yazılımı	Wanye Rasband, NIH, ABD	1.49d	görüntüleme analizi
Cihazlar/Aletler
İnfüzyon pompası	Harvard, Massachusetts, ABD	pompa 22( 55-2226)
Homeotermik battaniye	Panlab, Barselona, İspanya	HB101
Cep koter	Daejong, Seul, Kore	DJE-39
Beyin matrisi	Ted pella, CA, ABD	15003	koronal kesit
PE-50 boru	Natsume, Tokyo, Japonya	SP-45 (PE-50)	ID 0,58 mm OD 0,96 mm
PE-10 boru	Natsume, Tokyo, Japonya	SP-10 (PE-10)	ID 0.28mm OD 0.61 mm
30 gauge iğne	sungshim-medical, Seul, Kore
Şırınga	CPL-medikal, Ansan, Kore		1 & 3 cc
Gazlı Bez	Panamedic, Cheonan, Kore
Bant	Scotch, Seul, Kore	3M-810
Mikro forseps	Güzel Bilim Aletleri, Vancouver, Kanada	11253-27	Dumont #L5
Mikro makaslı	Güzel Bilim Aletleri, Vancouver, Kanada	15000-03	Vannas yaylı
Makaslı	Güzel Bilim Aletleri, Vancouver, Kanada	14084-08	8,5 cm
Siyah ipek sütür	Ailee, Busan, Kore	SK6071, SK728	6-0 ve 7-0
Reaktifler
Meloxicam	Yuhan, Seul, Kore
Veteriner merhem	Novartis, Basel, İsviçre
%10 Povidon-iyot (betadin)	Firson, Cheon-an, Kore
Ferric chloride	Sigma, Missouri, Amerika Birleşik Devletleri	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, ABD	0765-100g
Isofluran	Hana-Pham, Gyeonggi, Kore	Ifran	100 mL
PBS	Welgene, Daegu, Kore	LB001-02	500 mL
Altın nanopartikül			Sentezi
Normal tuzlu	su Daihan Pham, Seul, Kore	48N3AF3	20 mL