Uyanık bir sıçanda nöral aktivitenin hassas haritalanması için juxtacellular kayıt ve boyama

Abstract

Kaynak: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Uyanık, Başı Kısıtlanmış Sıçanların Subkortikal Beyin Yapıları İçindeki Tek Nöronların İzlenmesi ve Lokalizasyonu. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, kısıtlanmış, uyanık bir sıçanda yan yana hücresel kayıt ve boyama yöntemini göstermektedir. Prosedür, nöronlardan gelen sinyallerin kaydedilmesini ve kayıt bölgesini tam olarak lokalize etmek için boya enjekte edilmesini içerir. Bu teknik, nöral aktivitenin beynin anatomik yapısına doğru bir şekilde haritalandırılmasını sağlar.

Protocol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Nöronal Birimlerin Yan Yana Hücresel İzlenmesi

1. Uç çapları 1 μm'den küçük olan bir karbondioksit lazer mikropipet çektirmesi üzerine kuvars kılcal boruyu çekin (Şekil 2A).
   NOT: Isıtma parametreleri belirli cihaza göre değişecektir ve gerekli boyun çapı ilgilenilen beyin yapısına bağlı olarak değişecektir. Sıçan talamusundaki kayıtlar için mikropipetlerin boyunları 5-7 mm arasında değişir.
2. }Pipeti, uzun çalışma mesafesi hedefleriyle donatılmış bir diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu altında yerine sabitleyin. Pipeti mikroskop tablasında yerinde tutmak için modelleme kili kullanın.
3. Bir cam bloğu (0,5 - 1 cm kalınlığında; ultra mikrotom bıçakları yapmak için kullanılan bir cam parçası uygundur) pipet ucuyla yavaşça görüş alanına hareket ettirin. Sahne mikromanipülatörünü kullanarak pipet ucunu cama hafifçe dokundurun ve kırılmasına neden olun. Pipet ucu dış çapı 1-3 μm arasında olana kadar gerektiği kadar tekrarlayın (Şekil 2B, C). Bu mikropipetlerin empedanslarının yaklaşık 5-15 MΩ arasında olduğundan emin olun.
4. Hücre dışı salin hazırlayın (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit), NaOH ile pH 7.2) ve% 2 (a / h) Chicago Sky Blue ekleyin. Pipetin arka ucunu 30 G veya daha küçük bir iğne ile bir şırınga kullanarak solüsyonla doldurun. Alternatif olarak, tek hücreli juxtaselüler etiketleme için, Chicago Sky Blue yerine salin çözeltisine% 2 (a / h) Nörobiyotin veya biyotinile edilmiş dekstran amin (BDA-3000 veya BDA-10000) ekleyin.
5. Fareyi kumaş çorabın içine, sert tüpün içine uygun bir deneysel aparat üzerine yerleştirin (Şekil 1). Hayvanı baş desteği aparatına yerleştirmeden önce ameliyattan sonra en az 72 saat bekleyin. Hava yolunun tıkanmasını önlemek için büzme ipini boyun yerine üst sternumun etrafındaki sıkın. Nefes almak zor veya tıkanmış gibi görünüyorsa, büzme ipini gevşetin veya arkaya doğru hareket ettirin. Bu prosedürü sıçan uyanıkken gerçekleştirin.
6. Sıçan üzerindeki baş tutma plakasını jig üzerindeki ilgili parçaya takın. Bunu yapmak için önce koltuk başlığı plakasını yerine sabitleyin ve ardından 4-40'lık bir vida kullanarak sabitleyin. Kafaya aşırı tork uygulamaktan kaçınmak için hayvanın sakinleşmesini beklediğinizden emin olun. Ardından, sıçana implante edilen baş tutucu cıvataya 8-32'lik bir somun yerleştirin. Ardından dişli bir paslanmaz çelik çubuğu baş cıvatasına vidalayın. Çubuğu, yerine sıkılabilecek şekilde deney aparatına sabitleyin (Şekil 1).
   NOT: Hayvanın baş cıvatası ve baş desteği plakası ile sabitlenmesi, aparatın bükülmesini en aza indirir ve kayıt stabilitesini artırır. Çoğu durumda, kayıt, hayvanın başının bağlandığı ilk gün başlayabilir. Bununla birlikte, hayvan aşırı derecede kıpırdanırsa veya ses çıkarırsa, herhangi bir kayda başlamadan önce bir günlük baş desteği alıştırma eğitimi verin. Bu durumda, hayvanı 15 dakika boyunca jig üzerinde bırakın ve ardından kafesine geri koyun. Ertesi gün bu adımı tekrarlayın ve protokole devam edin.
7. Kayıt odasını açın ve silikon jeli çıkarın. Kraniyotomide doku yeniden büyümüşse, ince forseps kullanarak temizleyin.
8. Pipeti motorlu mikromanipülatöre takın ve başlık önünü prize takın.ampyükseltici.
   NOT: Mevcut gösterimde, kafa kademesindeki küçük bir röle devresi, amplifikatör kurşun kabloları ile yüksek uyumluluğa sahip bir harici akım kaynağı arasında geçiş yapar (Şekil 3A-C). Bazı amplifikatörlerin uygun bir yerleşik yüksek uyumluluk kaynağına sahip olduğunu unutmayın.
9. Pipetin ucunu kayıt odasında stereotaksik olarak tanımlanan işarete hareket ettirmek için motorlu mikromanipülatörü kullanın. Bu konumun koordinatlarını not edin. Pipetin ucunu kafatası üzerinde kırmamaya dikkat edin.
10. Pipeti ön-arka ve mediolateral eksenlerde istenen kayıt konumuna getirin. Ardından pipeti, amaçlanan kayıt konumuna yaklaşık 500 μm dorsal olana kadar dura boyunca ventral olarak ilerletin.
11. Pipet ucu ile referans teli arasında kaydedilen yükseltilmiş voltajın ses monitöründe ani yükselme olaylarını dinlerken pipeti yavaşça ilerletin. Ani yükselme olayları belirlendikten sonra, yaklaşık 0 μV'den daha büyük pozitif giden voltaj sapmaları gözlenene kadar pipeti 100-500 μm hareket ettirmeye devam edin.
    NOT: Bu gerçekleştiğinde elektrot direnci yaklaşık 1,5-10 kat artacaktır.
12. Kayıt, diğer tüm davranışsal ve fizyolojik ilgili önlemlerle birlikte bir birim izole edildikten sonra başlamalıdır. Bu gösterimde, kendi kendine üretilen vibrissa hareketleri yüksek hızlı videografi ile izlenmektedir (bkz. Materials section).
13. Kayıt alanını etiketlemek için, akım kaynağına bağlanmak için elektrot uçlarını değiştirin. Bunu yapmanın birkaç yolu vardır, bir röle devresi (Şekil 3A-C), amplifikatör üzerinde yerleşik bir akım kaynağı veya manuel olarak (Şekil 3D). Chicago Sky Blue'yu pipetten iyontoforetik olarak enjekte etmek için 4 dakika boyunca %50 görev döngüsünde 2 saniyelik darbelerle -4 μA geçirin.
14. Standart uygulamaya göre birkaç etiketleme prosedüründen sonra hayvanı öldürün ve perfüze edin. Beyni bölümlere ayırın ve kayıt bölgesinin anatomik konumunu belirlemek için gerektiği gibi karşı boyayın. Sitokrom oksidaz reaktivitesi için dokuyu lekeleyin. Alternatif olarak, floresan mikroskobu kullanarak Chicago Sky Blue birikintilerini tanımlayın.
    NOT: Farklı etiketli birimler arasında doğru bir ayrım yapmak için, tüm etiketlerin aynı gün aynı pipetle, etiketler arasındaki pipeti açmadan yapılması önemlidir. Bu durumda, kayıt siteleri, her bir sitenin belirtilen manipülatör koordinatları ile birlikte, post-hoc histolojideki göreceli konumlarına göre ayırt edilebilir. Kesin tanımlama için, etiketleri birbirinden en az 200 μm uzakta ve beyin bölgesi başına en fazla 3-5 etiket olacak şekilde işaretleyin.

Results

Resim 1: Deneysel aparat. Elektrofizyolojik ve davranışsal izleme deneyleri için mekanik jigdeki sıçan diyagramı. Jig, çubuk ve plakayı kullanır

Materials