Uyanık bir sıçanda nöral aktivitenin hassas haritalanması için juxtacellular kayıt ve boyama

Özet

Kaynak: Moore, J. D., et al. Juxtacellular Uyanık, Başı Kısıtlanmış Sıçanların Subkortikal Beyin Yapıları İçindeki Tek Nöronların İzlenmesi ve Lokalizasyonu. J. Vis. Uzm. (2015)

Bu video, kısıtlanmış, uyanık bir sıçanda yan yana hücresel kayıt ve boyama yöntemini göstermektedir. Prosedür, nöronlardan gelen sinyallerin kaydedilmesini ve kayıt bölgesini tam olarak lokalize etmek için boya enjekte edilmesini içerir. Bu teknik, nöral aktivitenin beynin anatomik yapısına doğru bir şekilde haritalandırılmasını sağlar.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Nöronal Birimlerin Yan Yana Hücresel İzlenmesi

1. Uç çapları 1 μm'den küçük olan bir karbondioksit lazer mikropipet çektirmesi üzerine kuvars kılcal boruyu çekin (Şekil 2A).
   NOT: Isıtma parametreleri belirli cihaza göre değişecektir ve gerekli boyun çapı ilgilenilen beyin yapısına bağlı olarak değişecektir. Sıçan talamusundaki kayıtlar için mikropipetlerin boyunları 5-7 mm arasında değişir.
2. }Pipeti, uzun çalışma mesafesi hedefleriyle donatılmış bir diferansiyel girişim kontrastı (DIC) mikroskobu altında yerine sabitleyin. Pipeti mikroskop tablasında yerinde tutmak için modelleme kili kullanın.
3. Bir cam bloğu (0,5 - 1 cm kalınlığında; ultra mikrotom bıçakları yapmak için kullanılan bir cam parçası uygundur) pipet ucuyla yavaşça görüş alanına hareket ettirin. Sahne mikromanipülatörünü kullanarak pipet ucunu cama hafifçe dokundurun ve kırılmasına neden olun. Pipet ucu dış çapı 1-3 μm arasında olana kadar gerektiği kadar tekrarlayın (Şekil 2B, C). Bu mikropipetlerin empedanslarının yaklaşık 5-15 MΩ arasında olduğundan emin olun.
4. Hücre dışı salin hazırlayın (135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 5 mM HEPES (4- (2-hidroksietil) piperazin-1-etansülfonik asit), NaOH ile pH 7.2) ve% 2 (a / h) Chicago Sky Blue ekleyin. Pipetin arka ucunu 30 G veya daha küçük bir iğne ile bir şırınga kullanarak solüsyonla doldurun. Alternatif olarak, tek hücreli juxtaselüler etiketleme için, Chicago Sky Blue yerine salin çözeltisine% 2 (a / h) Nörobiyotin veya biyotinile edilmiş dekstran amin (BDA-3000 veya BDA-10000) ekleyin.
5. Fareyi kumaş çorabın içine, sert tüpün içine uygun bir deneysel aparat üzerine yerleştirin (Şekil 1). Hayvanı baş desteği aparatına yerleştirmeden önce ameliyattan sonra en az 72 saat bekleyin. Hava yolunun tıkanmasını önlemek için büzme ipini boyun yerine üst sternumun etrafındaki sıkın. Nefes almak zor veya tıkanmış gibi görünüyorsa, büzme ipini gevşetin veya arkaya doğru hareket ettirin. Bu prosedürü sıçan uyanıkken gerçekleştirin.
6. Sıçan üzerindeki baş tutma plakasını jig üzerindeki ilgili parçaya takın. Bunu yapmak için önce koltuk başlığı plakasını yerine sabitleyin ve ardından 4-40'lık bir vida kullanarak sabitleyin. Kafaya aşırı tork uygulamaktan kaçınmak için hayvanın sakinleşmesini beklediğinizden emin olun. Ardından, sıçana implante edilen baş tutucu cıvataya 8-32'lik bir somun yerleştirin. Ardından dişli bir paslanmaz çelik çubuğu baş cıvatasına vidalayın. Çubuğu, yerine sıkılabilecek şekilde deney aparatına sabitleyin (Şekil 1).
   NOT: Hayvanın baş cıvatası ve baş desteği plakası ile sabitlenmesi, aparatın bükülmesini en aza indirir ve kayıt stabilitesini artırır. Çoğu durumda, kayıt, hayvanın başının bağlandığı ilk gün başlayabilir. Bununla birlikte, hayvan aşırı derecede kıpırdanırsa veya ses çıkarırsa, herhangi bir kayda başlamadan önce bir günlük baş desteği alıştırma eğitimi verin. Bu durumda, hayvanı 15 dakika boyunca jig üzerinde bırakın ve ardından kafesine geri koyun. Ertesi gün bu adımı tekrarlayın ve protokole devam edin.
7. Kayıt odasını açın ve silikon jeli çıkarın. Kraniyotomide doku yeniden büyümüşse, ince forseps kullanarak temizleyin.
8. Pipeti motorlu mikromanipülatöre takın ve başlık önünü prize takın.ampyükseltici.
   NOT: Mevcut gösterimde, kafa kademesindeki küçük bir röle devresi, amplifikatör kurşun kabloları ile yüksek uyumluluğa sahip bir harici akım kaynağı arasında geçiş yapar (Şekil 3A-C). Bazı amplifikatörlerin uygun bir yerleşik yüksek uyumluluk kaynağına sahip olduğunu unutmayın.
9. Pipetin ucunu kayıt odasında stereotaksik olarak tanımlanan işarete hareket ettirmek için motorlu mikromanipülatörü kullanın. Bu konumun koordinatlarını not edin. Pipetin ucunu kafatası üzerinde kırmamaya dikkat edin.
10. Pipeti ön-arka ve mediolateral eksenlerde istenen kayıt konumuna getirin. Ardından pipeti, amaçlanan kayıt konumuna yaklaşık 500 μm dorsal olana kadar dura boyunca ventral olarak ilerletin.
11. Pipet ucu ile referans teli arasında kaydedilen yükseltilmiş voltajın ses monitöründe ani yükselme olaylarını dinlerken pipeti yavaşça ilerletin. Ani yükselme olayları belirlendikten sonra, yaklaşık 0 μV'den daha büyük pozitif giden voltaj sapmaları gözlenene kadar pipeti 100-500 μm hareket ettirmeye devam edin.
    NOT: Bu gerçekleştiğinde elektrot direnci yaklaşık 1,5-10 kat artacaktır.
12. Kayıt, diğer tüm davranışsal ve fizyolojik ilgili önlemlerle birlikte bir birim izole edildikten sonra başlamalıdır. Bu gösterimde, kendi kendine üretilen vibrissa hareketleri yüksek hızlı videografi ile izlenmektedir (bkz. Materials section).
13. Kayıt alanını etiketlemek için, akım kaynağına bağlanmak için elektrot uçlarını değiştirin. Bunu yapmanın birkaç yolu vardır, bir röle devresi (Şekil 3A-C), amplifikatör üzerinde yerleşik bir akım kaynağı veya manuel olarak (Şekil 3D). Chicago Sky Blue'yu pipetten iyontoforetik olarak enjekte etmek için 4 dakika boyunca %50 görev döngüsünde 2 saniyelik darbelerle -4 μA geçirin.
14. Standart uygulamaya göre birkaç etiketleme prosedüründen sonra hayvanı öldürün ve perfüze edin. Beyni bölümlere ayırın ve kayıt bölgesinin anatomik konumunu belirlemek için gerektiği gibi karşı boyayın. Sitokrom oksidaz reaktivitesi için dokuyu lekeleyin. Alternatif olarak, floresan mikroskobu kullanarak Chicago Sky Blue birikintilerini tanımlayın.
    NOT: Farklı etiketli birimler arasında doğru bir ayrım yapmak için, tüm etiketlerin aynı gün aynı pipetle, etiketler arasındaki pipeti açmadan yapılması önemlidir. Bu durumda, kayıt siteleri, her bir sitenin belirtilen manipülatör koordinatları ile birlikte, post-hoc histolojideki göreceli konumlarına göre ayırt edilebilir. Kesin tanımlama için, etiketleri birbirinden en az 200 μm uzakta ve beyin bölgesi başına en fazla 3-5 etiket olacak şekilde işaretleyin.

Sonuçlar

Resim 1: Deneysel aparat. Elektrofizyolojik ve davranışsal izleme deneyleri için mekanik jigdeki sıçan diyagramı. Jig, çubuk ve plakayı kullanır

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Ketaset (Ketamin HCl)	Fort Dodge	N/A
Anased (Xylazine solüsyonu)	Lloyd Laboratories	N/A
Betadyne (Povidon-İyot)	CVS Eczane	269281
Loctite 495	Grainger Endüstriyel Tedarik	4KL86	20-40 cp siyanoakrilat
Vetbond	3M	1469SB
Kavrama çimento tozu	Dentsply Intl	675571	Kayıt odasının tabanı için
Kavrama çimento sıvısı	Dentsply Intl	675572	Kayıt odasının tabanı için
Silikon Jel	Dow Corning	Mar-80
Jet protez onarımı akrilik toz	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A Baş	dayanağı aparatını kafatasına sabitlemek için
Ortho-Jet Hızlı kürlenen ortodontik akrilik reçine sıvısı	Lang Dental Manufacturing Co.	N/A Baş	dayanağı aparatını kafatasına sabitlemek için
Chicago gök mavisi	Sigma	C8679
Paraformaldehit	Sigma	158127	Perfüzyon ve doku fiksasyonu için
Fosfat tamponlu salin	Sigma	P3813	Perfüzyon ve doku fiksasyonu için
Sitokrom C	Sigma	C2506
Diaminobenzidin	Sigma	D5905
Sıçan çorabı	Dikmek Zarif (San Diego, CA)	N / A
PVC tüp 2 1/2 "	ABD Plastik A.Ş.	34108
Subminiature D pinleri ve soketleri	TE Bağlantısı	205089-1
Paslanmaz çelik müzik kablosu 0.010 "çap	Precision Brand Products, Inc.	21010
Stereotaksik tutma çerçevesi	Kopf Instruments	Model 900
Stereotaksik kulak çubukları	Kopf Instruments	Model 957
Stereotaksik manipülatör	Kopf Instruments	Model 960
1/2 mm matkap çapağı	Henry Schein	100-3995
Sessiz Havalı diş matkabı	Midwest Dental	393-1600
Paslanmaz çelik 0-80 1/8 "vidalı	Bağlantı elemanı süpermarket	247438
0.2mL santrifüj tüpü	Fisher Scientific	05-407-8A
Özel kafa tutma çubuğu	UCSD SIO Makine Atölyesi	N/A
Dik açılı kelepçe sonrası Newport		MCA-1
8-32 3/4" vidalı	Bağlantı Elemanı Superstore	240181
4-40 1/4" vidalı	Bağlantı Elemanı Superstore	239958
Kuvars kılcal boru	Sutter Instruments	QF-100-60-10
Motorlu mikromanipülatör	Sutter Instruments	MP-285
Mikroelektrot amplifikatörü	Moleküler Cihazlar	Multiclamp 700B	Alternatif bölüm: Moleküler Cihazlar Axoclamp 900A
Mikroelektrot amplifikatör kafa aşaması	Moleküler Cihazlar	CV-7B	Alternatif bölüm: Moleküler Cihazlar ile HS-9Ax10 Axoclamp 900A
İzole nabız stimülatörü	AM Sistemleri	Model 2100	Alternatif bölüm: Moleküler Cihazlar ile HS-9Ax10 Axoclamp 900A
Ses monitörü	Radio Shack	32-2040
Elektrot kurşun teli	Cooner tel	NEF34-1646
Amplifikatör kafa aşaması	için röle COTO Teknolojisi	# 2342-05-000	(isteğe bağlı) Özel yapım bir baskılı devre kartı ile kullanılır (UCSD Fizik Elektronik Mağazası), Şekil 6A-C
Dijital video kamera	Basler	A602fm
Pipet tutucu	Warner Instruments	#MEW-F10T
Özel kafa tutma plakası	UCSD SIO Makine Atölyesi	N/A