$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.
1. Mezenkimal kök hücrelerin (MSC'ler) süperparamanyetik demir oksit (SPIO) Nanopartikülleri ile etiketlenmesi
- MSC'leri SPIO ile etiketlemek için, 6 mL etiketleme ortamı ekleyin (Dulbecco'nun modifiye edilmiş Eagle besiyerinde 25 μg / mL SBIO) (DMEM) fetal sığır serumu (FBS) olmadan) MSC'leri içeren bir T75 şişesine (% 80 birleşme).
- Hücreleri etiketleme ortamı ile bir CO2 inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2 ) çalkalamadan inkübe edin. 24 saat sonra, plastik ucu vakuma bağlı steril bir Pasteur pipeti kullanarak etiketleme ortamını nazikçe çıkarın. İçselleştirilmemiş SPIO izlerini gidermek için hücrelerin tek tabakasını 2x 6 mL fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın.
- Hücrelerin başarılı bir şekilde etiketlenip etiketlenmediğini belirlemek için, SPIO'nun bir florofor ile etiketlenip etiketlenmediğini floresan mikroskop veya konfokal mikroskop altında etiketli hücreleri kontrol edin (yani, burada kullanılanlar gibi; Şekil 1B, C).
- Yapışan hücreleri 3 mL tripsin ile muamele ederek hasat edin ve 37 ° C'de inkübe edin. 5 dakikalık inkübasyondan sonra, tripsini etkisiz hale getirmek için% 10 FBS (h / v) ile 7 mL önceden ısıtılmış DMEM ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu bir pipet kullanarak 15 mL'lik konik bir tüpe toplayın.
- Hücre süspansiyonunu 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücre peletini PBS'de yeniden süspanse edin. Tripan mavisi boya ve bir hemositometre kullanarak canlı hücreleri sayın.
NOT: Etiketli hücrelerin hücre peleti, demir yüklemesi nedeniyle koyu bir renk olarak görünecektir (Şekil 1D). Bu protokol MSC etiketleme ve manyetik rezonans görüntüleme (MRI) ile ilgilidir. MSC etiketleme prosedürü daha önce optimize edilmiştir ve in vivo izleme odak noktası olduğundan, burada yalnızca etiketli MSC'leri in vivo izlemeye hazırlama adımları dahil edilmiştir. Diğer hücre tiplerinin kültürlenmesi ve etiketlenmesi için protokol araştırmacı tarafından optimize edilmelidir. - PBS kullanarak hücre konsantrasyonunu 18 μL PBS'de (veya intranazal uygulama prosedüründe kullanılacak toplam hacimde) 150.000 hücreye (veya yeterli bir MRI sinyaliyle sonuçlanan bir sayıya) ayarlayın.
NOT: 150.000 hücre / 18 μL PBS'den daha yüksek bir hücre konsantrasyonunun hücre agregasyonuna yol açtığı fark edildi, bu da intranazal doğumun etkinliğini etkileyebilir. İntranazal doğum için daha fazla sayıda hücreye ihtiyaç duyulursa, intranazal uygulama non-invaziv bir prosedür olduğundan ve çoklu dozlama mümkün olduğundan, toplam hücre süspansiyonu hacmini artırın ve intranazal uygulama sayısını artırın.
2. Kontrollü Kortikal Etki (CCI) Yaralanması
NOT: Bu protokolde, erkek C57 BL / 6 fareleri (7-8 haftalık), yiyecek ve suya ad libitum erişimi ile 12/12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu.
- Her fareyi CCI hasarına hazırlamak için, zolazepam (50 mg / kg) ve ksilazin (20 mg / kg) anestezik kokteyli intraperitoneal (ip) enjeksiyon (1 mL / kg) yoluyla uygulayın. Anestezi derinliğinin, ayak parmağını sıkıştırma tepkisi eksikliği nedeniyle yeterli olduğundan emin olun. Alternatif olarak, fareyi 60 saniye boyunca %2-4 izofluran içeren bir odaya yerleştirin.
- Elektronik bir saç kesme makinesi kullanarak kafatasının sırt yüzeyinin kürkünü kulaklar arasında tıraş edin. İyotla ıslatılmış steril bir pamuklu çubuk kullanarak traşlı alanı birkaç kez temizleyin. İyotu temizlemek için %70 etanole batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın.
- Anestezi uygulanmış fareyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin ve fareyi kulak çubukları ve burun çubukları kullanarak sabitleyin. Kafatasının yüzeyine erişmek için steril makas kullanarak traşlı deride orta sagital bir kesi (yaklaşık 2,5 cm) yapın.
- Kafatasını ortaya çıkarmak için pamuklu bir ped kullanarak kemik üzerindeki dokuyu çıkarın. Kafatası yüzeyini 10 saniye boyunca %3 hidrojen peroksit (H2O2) içine batırılmış bir pamuklu çubuk kullanarak temizleyin, ardından kuru bir pamuklu ped ile temizleyin.
NOT: Kafatası dikişleri ve hem bregma hem de lambda artık kolayca tanımlanabilir. - CCI yaralanması için kafatası yüzeyinde tercih edilen koordinatları belirleyin ve bir kalem veya uygun bir işaretleyici kullanarak koordinatların etrafına bir daire (4 mm çapında) çizin.
NOT: Bu protokolde, CCI indüksiyonu için anteroposterior (AP) -2.0 mm ve mediolateral (ML) +1.5 mm'deki koordinatlar kullanıldı. - Kafatasını işaretli dairede inceltmek için bir mikro matkap ve yuvarlak çapak (0,5 mm çapında) kullanın. Delme sırasında basınç uygulamaktan kaçının, çünkü kemiği delmek beyin parankimine zarar verebilir. Temiz ve kuru bir pamuklu çubuk kullanarak kemik tozunu temizleyin.
- Dura mater'i sağlam tutarken ortaya çıkarmak için steril ince forseps kullanarak kemik flebini nazikçe çıkarın. Fareyi yaralanma öncesi hazırlık için kullanılan stereotaktik çerçeveden çıkarın ve CCI cihazının stereotaktik çerçevesine yerleştirin.
- Kulak çubuklarını ve burun çubuklarını kullanarak farenin kafasını sabitleyin. Farenin başının rostral-kaudal yönde düz olduğundan emin olun ve gerekirse burun çubuklarını ayarlayın.
- Çarpma tertibatı ucunu açıkta kalan kortikal yüzeye sıfırlamak için kontrol kutusundaki talimatları izleyin. Çarpma tertibatı ucunun, çarpma tertibatının tabanındaki X ve Y kontrol tekerlekleri kullanılarak darbe almak istenen korteks koordinatlarının doğrudan üzerine hizalandığından emin olun.
- Farede hafif yaralanmaya neden olmak için 5 m/s hıza, 250 ms bekleme süresine ve 1 mm yaralanma derinliğine sahip kontrol kutusunu kullanarak deney parametrelerini ayarlayın.
- Kontrol kutusundaki "darbe" düğmesine basarak yaralanmaya neden olun. Steril bir pamuklu çubuk kullanarak meydana gelen herhangi bir kanamayı temizleyin.
- Fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın ve ipek cerrahi dikişler kullanarak kesiyi kapatın. Fare MRG için manyetik alana maruz kalacağından, cerrahi bölgeyi kapatmak için metal klipsler kullanmayın.
- Enfeksiyonları önlemek için cerrahi bölgeye topikal antibiyotikler (basitrasin neomisin) uygulayın. Fareyi ısıtma yastığının üzerinde tutun ve kurtarma aşamasında yakından izleyin.
- Ketoprofen uygulaması çalışma hedefleriyle çelişmedikçe, ameliyattan sonraki 3 gün boyunca günde ketoprofen (2.5 mg / kg, IP) uygulayın.
3. İntranazal Doğum
- CCI indüksiyonundan 1 gün sonra, zolazepam (50 mg / kg) ve ksilazin (20 mg / kg) anestezi kokteylini i.p. enjeksiyonu ile uygulayın. Farenin ayak parmağını kıstırma tepkisi olmaması nedeniyle derin bir şekilde uyuşturulduğundan emin olun.
- Fareyi hyaluronidaz tedavisi ile MSC'lerin intranazal uygulaması için hazırlayın.
- Farenin tırnağını tutun ve kafatasını hareketsiz hale getirirken sıkıca sırtını çevirin. Hyaluronidaz içeren bir pipetin ucunu steril PBS'de (4 U/μL) farenin burun deliğinin yakınına 45° açıyla yerleştirin.
- Her burun deliğine 3 μL hyaluronidaz süspansiyonu uygulayın. Fareyi 5 dakika boyunca hareketsiz ve temiz bir ped üzerinde yukarı bakacak şekilde tutun. Hyaluronidaz tedavisini 4x tekrarlayın (toplam 100 U hyaluronidaz süspansiyonu).
- Hyaluronidaz tedavisinden sonra, tedavi edilen fareyi 30 dakika boyunca yukarı bakacak şekilde temiz bir ped üzerinde tutun.
- MSC'leri beyne iletmek için, adım 3.2.1'de açıklandığı gibi fareyi sıkıca tutun. 3 μL/burun deliği MSC süspansiyonunu 3 saniye aralıklarla uygulayın. Örnek damlalar tamamen kaybolana kadar fareyi 30 saniye boyunca aynı konumda tutmaya devam edin.
NOT: Uygulama sırasında hava kabarcıkları oluşturmaktan kaçının. - Uygulamayı 2 dakikalık aralıklarla 3x.NOT: Verilecek toplam hücre sayısı 150.000'dir, öyle ki 18 μL hücre süspansiyonu, her burun deliği için 3 μL, her biri 3 kez olmak üzere 3 μL'lik bir dozajda verilebilir.
- Fareyi kafesine geri koyun ve anesteziden tamamen iyileşene kadar yakından izleyin.
