Uyanık Bir Sıçanda Motor Korteksin Transkraniyal Elektriksel Stimülasyonu

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Cerrahi İşlem: Göğüs Elektrodu İmplantasyonu

NOT: Karşı elektrot traşlı göğsün üzerine bir yelek ile harici olarak yerleştirildiğinde bu adım atlanabilir.

1. Kemirgeni yüzüstü (göğsüne) ameliyat masasına yerleştirin.
   NOT: İnhalasyon anestezisi durumunda, farenin burnunu anestezi memesine yerleştirin ve izofluran konsantrasyonunu% 1.5-2'ye düşürün.
2. Tıraşlı saç derisini dezenfektan bir spreyle veya antiseptik bir maddeye batırılmış bir çubukla (örneğin, etanol% 70) dezenfekte edin ve kurumaya bırakın. İki kez tekrarlayın.
3. Cildi bir neşter ile rostral göz hizasından orta kulak hizasına kadar tek bir çizgide kesin.
   NOT: Bu, bağlantı kablosunun implante edilmiş göğüs elektrodundan başın üst kısmına doğru tünellenmesine izin verir ve aynı zamanda doğru akım stimülasyonu (DCS) elektrot soketi yerleşimi için istenen kesimdir.
4. Fareyi sırtüstü pozisyona getirin, böylece göğüs açıkta kalır.
5. Göğüs derisini adım 1.2'de anlatıldığı gibi dezenfekte edin.
6. Sağ göğsün yan derisini doku forseps ile yükseltin ve sağ koltuk altından yaklaşık 0,5 cm medial küçük bir makasla bir ilik açın. Ardından, makasla kraniyal yönde düz bir sagital kesim yapın.
7. Cildi sol ana göğüs kasından atravmatik olarak ayırarak deri altı bir kese oluşturun. Bunu, küçük makası tekrar tekrar açarak (veya tuzlu suyla ıslatılmış bir pamuklu çubukla) yapın.
8. Homeostatik forseps kullanarak yüzeysel fasyaya nüfuz ederek göğüs kesesine çıkmak için açılan kafa derisinin sol oksipital köşesinden kablo yolunu boyun boyunca tünellemek için hayvanı sağ tarafına çevirin.
9. Keskin tellerin sapmasına izin vermeden platin elektroda bağlı elektrot kablosunun ucunu tutmak için homeostatik forsepsleri dikkatlice açın. Elektrot torbaya girene kadar kabloyu tünelden çekin, lehim noktası kemirgenin sol arka ayağına doğru yönlendirildi. Kemirgeni yüzüstü pozisyona geri çevirin.
10. Platin plakayı steril sentetik örgülü, emilmeyen bir sütür ile karşılıklı iki köşe deliğindeki pektoral fasyaya sabitleyin (stabilite için 4-5 deniz mili önerilir).
11. Benzer şekilde, kabloyu gevşek bir düğümle ön panoya takın ve doku tünelinin girişinden önce hafif bir halka oluşturun.
12. Kesiğin boyutuna bağlı olarak cildi 3-4 deri dikişle kapatın (elektrot ve kablo için aynı dikiş materyali kullanılabilir).

2. Cerrahi Prosedür: Epikraniyal Transkraniyal Elektriksel Beyin Stimülasyonu (tES) Soketinin Yerleştirilmesi Hayvanı

1. stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin.
   NOT: İnhalasyon anestezisi kullanılıyorsa, anestezik konsantrasyonunu, ayak parmağı kıstırma refleksine ve solunum düzenine göre ayarlanmış ~% 1.5-1'lik bir idame izofluran akışına düşürün.
2. Tıraşlı saç derisini adım 1.2'de anlatıldığı gibi dezenfekte edin.
3. Cildi bir neşter ile rostral göz hizasından orta kulak hizasına kadar tek bir çizgide kesin.
   NOT: Göğüs elektrodu yerleştirildiyse, 2.2 ve 2.3 adımları zaten gerçekleştirilmiştir.
4. Neşter ile periosteuumu (kafatasındaki bağ dokusu) yanlara doğru kazıyın ve pamuklu çubuklarla iyice silin. Kesiğin 4 köşesindeki bağ dokusunu bulldog kelepçeleri ile sabitleyin ve ameliyat alanını açık tutmak için yanlamasına asılmasına izin verin.
5. Kemik yüzeyini ve dokuyu pamuklu çubuklarla temizlemek için% 0.9 salin uygulayın. Daha sonra kemik yüzeyini %3 H₂O₂ ile temizleyiniz. Doku ile temasından kaçının. Bu sayede kemik daha derinlemesine temizlenir ve kemikten küçük kanamalar durdurulur. Ayrıca, periosteum kalıntıları görünür hale gelir. Bu kalıntıları pamuklu çubukla orta derecede basınç uygulayarak çıkarın.
   NOT: Periosteum kalıntılarının çıkarılması, kemiğe yapıştırılan tES soketinin yapışmasını ve dayanıklılığını artıracaktır.
   1. Durdurulamayan kanama durumunda, bir kemik matkabı kullanın ve kemiğe hafif bir baskı uygulayarak 1-3 saniye boyunca dokunun. Bu mekanik prosedür, çoğu durumda, önemli bir ısınma olmadan kanamayı durduracaktır. Kemik üzerinde asla elektrokoter kullanmayın; Kısa bir uygulama bile beyin dokusu hasarına neden olacaktır (elektrokoter sadece yara dokusu kanaması için kullanılmalıdır).
6. Sabitleme vidaları kurulum yapışmasını iyileştireceğinden, vida boyutuna uygun bir matkap ucu seçin. El matkabı ile ön delme ve ardından kemik matkabı ile hafif dikey basınç uygulayarak iki farklı kemik plakasına iki çapak deliği yerleştirin. Elektrotun vidalanmasını engelleyebileceğinden, tES soketinin istenen konumuna yakın olmaktan kaçının (örneğin, sol birincil motor kortikal tES için sağ ön ve arka parietal vida konumunu seçin).
7. İmplante edilmiş bir karşı elektrot durumunda, tünelli kablonun gelecekteki sabitlenmesi için sağ arka parietal kemikte bulunan üçüncü bir deliği çapaklayın.
8. Plastik vidaları çapak deliklerine yerleştirin ve ilk sürtünme hissedilene kadar vidalayın. Ardından üç adet ek 180 ° vida dönüşü gerçekleştirin. Forseps ile vidanın stabilitesini kontrol edin ve yeterince sıkı değilse bir tur daha ekleyin.
   NOT: Yetişkin sıçanlar için bu, dura veya beyne zarar vermeden vidaların epidural yerleştirilmesini sağlayacaktır (vida dişi tasarımına bağlı olarak, dönüş sayısı değişebilir). Paslanmaz çelik vidaların kullanılması da mümkün olmalıdır, çünkü nörodejenerasyon eşiğinin üzerindeki DCS akım yoğunluklarında bile; Vida yerleşimi, lezyonun yerini veya vidaların altındaki kapsamını bozmadı.
9. Havyayı açın ve yaklaşık 5 dakika önceden ısıtın. Doku tünelinden çıkan kabloyu oksipital olarak sağ parietal vidanın etrafına sarın ve ardından sargının arkasında yaklaşık 1 cm kablo bırakarak kesin. Kablonun ucundaki yalıtımı bir neşterle dikkatlice soyun.
10. Sarılmış kabloyu siyanoakrilik yapıştırıcı ile vidaya ve kemiğe sabitleyin.
11. Konektöre ve karşı elektrot kablosunun çıplak tellerine az miktarda kurşunsuz kalay lehim uygulayın ve kalay lehim eriyene kadar lehim ucuna dokunurken önceden lehimlenmiş her iki parçayı birbirine kısaca bastırarak her ikisini de bağlayın (yaklaşık 2-3 s). Kablonun aşırı metal ısınmasını ve ardından doku hasarını önlemek için lehim ucunu hemen çıkarın.
12. Bükülmüş, tırtıklı uçlu forsepsli özel yapım tES elektrot soketini (Şekil 1B, kırmızı) alın ve soketin alt kenarına ince bir tabaka siyanoakrilik yapıştırıcı sürün. Motor korteksin üzerine yerleştirmek ve 4 mm çapında bir soket kullanmak için, orta soket noktasını bregmadan 2 mm ön ve 2 mm yana yerleştirin. Bu pozisyon için, soketin iç medial sınırı doğrudan sagital sütürde bitmeli ve kaudal sınır bregma yüksekliğinde sona ermelidir. Soketi kemiğin üzerine kısa bir süre bastırın (çoğu siyanoakrilik yapıştırıcı basınçla sertleşir).
    NOT: Bir ışık kaynağını doğrudan soketin üzerine yerleştirmek, soketin yerleştirilmesini kolaylaştırabilir.
13. Soket alanındaki kemikte yapıştırıcı bulunmadığından emin olun (yapıştırıcı yansıtıcı olduğu için ışıkla kontrol ederek). Yapıştırıcı dökülmesi durumunda, soketi çıkarın, yapıştırıcıyı neşterle kazıyın ve 2.12 adımını tekrarlayın.
14. Soket yerleştirildikten ve gelecekteki stimülasyon alanı tutkaldan arındırıldıktan sonra, bu konumda akımın şöntlenmesine yol açabilecek bir sıvı köprüsünü önlemek için önce soketin yan sınırını komşu dokuya küçük bir damla siyanoakrilik yapıştırıcı ile kapatın. Stimülasyon alanına akabileceğinden çok fazla yapıştırıcı uygulamayın (bu meydana gelirse, adım 2.12'ye dönün).
    NOT: Stimülasyon alanının azaltılması akım yoğunluğunu (A/m²) önemli ölçüde artırabileceğinden, stimülasyon alanını yapıştırıcıdan uzak tutmak çok önemlidir.
15. Tüm vidaları siyanoakrilik yapıştırıcı ile kaplayın.
16. İki bileşenli dental akrilik çimentoyu küçük bir silikon tüp veya cam içinde karıştırın. Viskoz hale gelir gelmez, soketin kalan kenarlarını kemiğe kapatmak için bir diş spatulası ile uygulayın. Stimülasyon alanına herhangi bir dental akrilik çimento akışından kaçının.
17. Son olarak, tüm kafatasını, vidaları, karşı elektrot kablosunu ve soketin 1 / 3'üne kadar olan soketi dental akrilik çimento ile kaplayın. Çimentonun doğru viskoziteye sahip olduğundan emin olun: çok akışkansa, çevredeki dokuya akacaktır; Çok sertse, eşit olarak dağıtmak zordur.
18. Tüm kemik kaplandığında ve çimento sertleştiğinde, bulldog kelepçelerini çıkarın; cilt sadece biriken çimentoya temas etmelidir, böylece dikiş atılmasına gerek kalmaz. (İlk kesi çok uzun seçilmişse ve bağ dokusu veya kas görünüyorsa, adım 1.12'de anlatıldığı gibi bir dikiş uygulayın).
19. Kesilen cildin kenarına pamuklu çubukla bir kat iyot uygulayın ve deri altına carprofen enjekte edin (ağrı tedavisi ve sıvı replasmanı için 5-7.5 mL% 0.9 salin içinde çözülmüş 5 mg / kg vücut ağırlığı).
    NOT: İnhalasyon anestezisi kullanıyorsanız, şimdi kapatın.
20. Kemirgen uyanana ve duruş stabilitesi geri gelene kadar kemirgeni anesteziden kurtulmak için bir ısıtma kutusuna koyun.
    NOT: Kurumun tavsiyesine göre hayvanın kilo gelişimini, yara durumunu ve genel sağlık kriterlerini günlük olarak kontrol edin.

3. Transkraniyal Elektrik Stimülasyon Prosedürü

NOT: Anestezi tES etkilerini etkilediğinden, stimülasyonun mümkün olduğunda uyarı kemirgenlerinde yapılması önerilir. Deneylere başlamadan önce kemirgenin en az 5 gün iyileşmesine izin verin (baş ve göğüs yarasının iyileşmesi). Göğüs yarası en irritabl olduğundan, bir yelekle sabitlenmiş harici bir karşı elektrot kullanıldığında ameliyattan sonra daha erken zaman noktalarında deneyler yapılabilir, ancak hayvanların birkaç gün boyunca elektrot yeleğine alışması gerekir ve davranışsal görevlere müdahale olabilir.

1. tES elektrot soketinin yarısını %0,9 salin ile doldurun ve hava kabarcıklarını çıkarın.
2. Katodal transkraniyal doğru akım stimülasyonu (tDCS) seanslarından önce daima klorlamayı kontrol edin ve gerekirse (parlak gümüş bir yüzey gibi) Ag / AgCl elektrodunu yeniden klorlayın. Anodal tDCS seanslarından önce, stimülasyon sırasında iyi bir iletkenlik sağlamak için önceki stimülasyonlardan olası fazla AgCl birikintilerini zımpara kağıdı ile temizleyin. tES elektrot vidalı kapağını vidalayın (Şekil 1B, gri parça).
   DİKKAT: Katodal tDCS seansları arasında elektrotun yeniden klorlanmaması, stimülasyon sırasında klorlamanın tükenmesine ve elektrokimyasal reaksiyonla toksik birikime yol açacaktır. Bu doku hasarına neden olur. Stimülasyon süresi 20 dakikadan kısaysa, tek bir seansta yeniden klorlamaya gerek yoktur.
3. Kabloları kafadaki iki konektöre bağlayın (anodal stimülasyon için anodal kablosu vidalı kapaktaki konektöre bağlanır, katodal stimülasyon için tam tersidir).
   NOT: Harici olarak yerleştirilmiş bir karşı elektrot kullanırken, karşı elektrodu iletken jel ile örtün ve kemirgenin göğsüne yerleştirin. Elektrot, kemirgenin stimülasyon sırasında giyebileceği küçük bir kemirgen yeleğine önceden sabitlenmişse, bu en kolay yoldur.
4. Kemirgeni, serbest harekete izin veren kafesin üzerindeki bir fırdöndüye bağlı olacak şekilde deney kafesine yerleştirin.
5. Stimülatörü açın ve stimülasyon parametrelerini ayarlayın (stimülasyon yoğunluğu, süresi, rampa yukarı ve aşağı süresi).
6. Güvenlik kapatma ve bağlantı kesme alarmı olan piyasada bulunan bir stimülasyon cihazı kullanılmadığında, sabit akım akışını kontrol etmek için devreye bir sayaç ekleyin.
   NOT: Bu kurulumla, davranışsal görevlerin yerine getirilmesi veya eğitimi sırasında stimülasyon uygulanabilir.
7. Stimülasyon sırasında kemirgende stres veya rahatsızlık belirtileri olup olmadığını kontrol edin.
8. Stimülasyonun sona ermesinden sonra, kabloları ayırın, kafadaki elektrot kapağını sökün ve soketi pamuklu çubukla temizleyin ve kurulayın. Kemirgeni ev ortamına geri koyun veya istenirse davranışsal bir prosedürle devam edin.

Şekil 1: tES soketi ve elektrot kapağı ünitesinin ameliyatı ve teknik şeması için malzemeler. (A) 1. Pamuklu çubuklar, 2. dezenfektan, 3. Stereotaktik çerçeve, 4. havya, 5. analjezik (ör., carprofen), 6. & 7. anestezikler (örneğin, ksilazin ve ketamin), 8. Şırınga, 9. Makas, 10. kulak zımbalayıcı, 11. göz merhemi (örneğin, bepanthene), 12. kurşunsuz kalay lehim, 13. iki bileşenli dental akrilik çimento (DAC), 14. İyot, 15. % 3 H2O2, 16. % 0.9 tuzlu, 17. sentetik örgülü emilmeyen sütür (örneğin, Mersilene 4-0), 18. matkap uçları, 19. siyanoakrilik yapıştırıcı, 20. Bulldog kelepçeleri 21. homeostatik forseps, 22. Bükülmüş, tırtıklı uçlu forseps, 23. Düz, keskin uçlu forseps, 24. düz, doku forsepsleri, 25. diş spatulası, 26. Neşter, 27. Makas, 28. El matkabı, 29. tornavida, 30. Motor tahrikli matkap, 31. dişi konektörler, 32. tES soketi, 33. Kabloya bağlı kare platin elektrot, histoakrilik yapıştırıcı ile kaplanmış lehim bağlantısı, 34. plastik vidalar. (B) iç çapı 4 mm olan kemirgen kafatasına sabitleme için tES soketi (kırmızı); elektrot ünitesi (gri), bir vidalı kapak ve damganın altına yapıştırılmış Ag / Cl disk elektrodunun kablosu için yer bırakan bir merkez deliği olan bir iç damga ile inşa edilmiştir. Bu, kurulumun maksimum stabilitesine ve hassas tel-elektrot bağlantı noktasında kablo kopmalarının önlenmesine olanak tanır.