Cut-yükleme: Retina Nöronlar arasında Gap Junction Tracer Kaplin Kapsamı incelenmesi için yararlı bir araçtır

Özet

Retinal nöronlar arasındaki boşluk kavşak tracer kaplin kapsamını belirlemek için kolay ve kullanışlı bir yöntem açıklanmıştır. Bu teknik, bir gece ve gündüz farklı zamanlarda farklı aydınlatma koşulları altında ve sağlam retina nöronlar arasındaki elektriksel sinaps işlevini incelemek için olanak sağlar.

Özet

Kimyasal sinaptik iletim ek olarak, gap junction bağlı nöronların elektrik sinaptik iletim yoluyla hızlı bir şekilde iletişim kurabilir. Giderek artan kanıtlar gap junction sadece elektrik akım ve birbirine bağlı veya birleştiğinde hücreleri arasındaki senkron faaliyet izni olduğunu gösterir, ancak birleştiğinde hücreleri arasındaki gücü veya elektrik iletişimin etkinliğini büyük ölçüde ^1,2 modüle olabilir. Buna ek olarak, birçok gap junction kanalları büyük iç çapı (~ 1.2 nm), gap junction, metabolik ve kimyasal iletişim aracılık edebilir, böylece, hücre içi sinyal molekülleri ve birbirine bağlı hücreler arasındaki küçük metabolitleri difüzyon sadece elektrik akım izin verir, ancak . Nöron ve nörotransmitter ve diğer etkenlere göre modülasyon arasındaki junctional iletişim gücü birleştiğinde hücreleri aynı anda elektrikle kayıt ve t belirleyerek incelenecektir.iyontoforez tek hücre içine enjeksiyonu takiben GAP kavşak geçirgen tracer molekülleri, difüzyon ölçüde değil membran geçirgen. Ancak, bu işlemler, bozulmamış sinir dokusunda küçük somata nöronlar üzerindeki gerçekleştirmek için son derece zor olabilir.

Her beş retina nöron tipi elektrikle gap junction ^3,4 ile bağlı olduğundan, elektrik sinapslar ve elektrik iletişim modülasyon çok sayıda çalışmalar, gözdeki yapılmıştır . Artan kanıtlar, retina ışık stimülasyon ve değişiklikler sirkadiyen (24 saatlik) ^saat 3-8 kaplin boşluğu kavşak düzenlenmesi göstermiştir . Örneğin, yakın zamanda yapılan çalışmalar göstermiştir retina sirkadiyen saat, gün boyunca, artan dopamin D2 reseptör aktivasyonu ile D2 reseptör aktivasyonu azaltarak çubuk ve koni fotoreseptör hücreleri arasındaki kavşak kaplin azalır ve dramatik bir gece çubuk koni kaplin artar Burada, gece ve gündüz farklı zamanlarda, farklı aydınlatma koşulları altında ve retinal nöronlar arasındaki boşluk kavşak tracer kaplin ölçüde belirleyen basit bir yöntem mevcut. Bu kesim yükleme tekniği açık gap junction kanalları aracılığıyla boya yükleme ve difüzyon dayalı kazıma yükleme değişiklik, ^9-12. Pençe yükleme kültür hücreleri sağlam retina gibi kalın dilim iyi çalışır, değil. Yükleme kesim tekniği bozulmadan balık ve memeli retina ^{7, 8,13} fotoreseptör kaplin çalışma olmuştur arasındaki kaplin incelemek için kullanılabilirburada açıklandığı gibi diğer retinal nöronların.

Protokol

1. Japon balığı, fare ve tavşan için bozulmamış nöral retina hazırlıkları

1. Sürekli ortam (arka plan) aydınlatma altında açıklanan olanlar da dahil olmak üzere aşağıdaki adımları, "2) Cut-yükleme," gerçekleştirin. Bu protokolün amacı, prosedürleri (yani çok karanlık (yani "scotopic") koşulları altında ≤ 0.0001 lux) gece görüş kızıl ötesi gözlük kullanarak sürekli karanlıkta olarak gerçekleştirilen açıklanan, ancak diğer yüksek yoğunluk seviyeleri sürekli ortam aydınlatma, unutmayın gap junction tracer kaplin ortam aydınlatma diğer seviyelerde etkisini belirlemek için yerine kullanılabilir.
2. Koyu ameliyat öncesi en az 1 saat süreyle deneysel hayvan (Japon balığı, fare ve tavşan) uyum.
3. Daha önce ⁷ açıklanan derinden tricaine methanesulfonate (MS222 balık deposu su tamponlu (sodyum bikarbonat içeren) 150 mg / L) koyarak goldfish uyutmak ve derin ketamin (100 mg olan farelerin uyutmak/ Kg, ip) ve rompun (10 mg / kg, ip). Derinden üretan ile tavşan uyutmak (yükleme dozu: 2,0 g / kg, ip) ve aynı zamanda yerel intraorbital anestezi (2% Xylocaine) kullanımı, daha önce ⁸ tarif. Hayvanların bakım ve kullanımını içeren tüm deneysel işlemleri federal kurallarına uygun olarak yapılmalı ve yerel üniversite hayvan bakımı ve kullanımı komiteleri tarafından gözden geçirilmeli ve onaylanmalıdır. (Not: burada açıklanan deneyler, balıkların bakımı ve kullanımı ile ilgili tüm deneysel prosedürleri, fare ve tavşan NIH kılavuzunda uygun olarak yapıldı ve incelendi ve Ohio State Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan)
4. Balık, fare ve tavşan için, aşağıdaki enükleasyon, her gözün ön kısmını kaldırın. Daha sonra, filtre kağıdı, gözün arka bölümünün altında böylece, gözün arka kısmının üstüne filtre kağıdı bir parçası yerleştirin ve filtre kağıdı ve göz ters. Daha sonra, ince kullanarakforseps yavaşça, nöral retina, filtre kağıdı bağlı, birbirlerine bağlıdırlar pigment epiteli / koroid / sklera, uzak soyma sağlam nöral retina gözün arka bölümünü teşrih. Bunu yaparken, ince yaylı makas kullanılarak optik sinir kesti. Nöral retina, fotoreseptör tarafı odaklı kadar, filtre kağıdı bağlı ve göz geri kalanından ayrılmış olmalıdır.

2. Cut-yükleme

1. Ile sürekli ortam (arka plan) aydınlatma (örneğin, çok karanlık (yani "scotopic") koşulları altında) altında 30 dakika için bir 6-iyi plaka (~ 5 ml / iyi) olarak ya da olmadan oksijenli Ringer Kullanıcı çözüm (Tablo 1) Batmak retina Bir test ilaç. Parafilm ile 6-iyi plaka mühürleme oksijenli içinde balık retina (5% CO ₂ /% 95 O ₂₎ 22 bikarbonat-tabanlı Zil ° C koruyun ve bir% 5 CO 36 ° C fare ve tavşan retina korumak ₂ / 95% O
2. Ringer çözeltisi ile kesme retinanın hemen önce neurobiotin (% 0.5), bir biotinlenmiş molekülü eriterek izleme çözümü (genellikle 100 mcL) hazırlayın. % 0.5 rodamin dekstran (yüksek (> 10.000) MW) çözüm olabilir. Yüksek molekül ağırlığı nedeniyle, rodamin dekstran gap junction ve sadece etiket kesim tarafından zarar görmüş hücreleri geçemez. Şekil. 3, bu yaralandı çünkü gap junction aracılığıyla difüzyon tracer birikmiş bu neurobiotin biriken hücreler ayırt etmek için bir yoldur.
3. Neurobiotin çözüm bir cam veya plastik Petri kabı yerleştirin, aşırı Zil kaldırmak neurobiotin çözümü bir jilet (ya da başka bir keskin bıçak) daldırma ve retinaya bağlı olduğu filtre kağıdı, kağıt havlu üzerine dokununn retina ve filtre kağıdı ile radyal bir kesim olun. Ayırıcılar Tercih edilmesi durumunda, retina ile yapılan kesme, ancak filtre kağıdı olduğunu kullanılmalıdır olabilir. Kesilen retina yüzeyine dik odaklı olmalıdır. Neurobiotin çözüm jilet tekrar batırın ve retina ikinci kez kesmek. Retinanın başına 4 kesim (bkz. Şekil 1) Bu kadar tekrarlayın. Fare ve diğer küçük retina aracılığıyla jilet keser yaparken bir diseksiyon mikroskobu kullanın.
4. Şekil. 6 plaka (5 ml Ringer / kuyu) kullanarak ya da test ilaçsız 1, batığın taze Ringer ortamda tekrar retina,. Retina, yükleme ve difüzyon izin vermek için 15 dakika süreyle inkübe edin.
5. 5 dakika, her taze Ringer orta ile veya test ilaçsız üç kez yıkayın.
6. % 4 paraformaldehid oda sıcaklığında 1 saat için 0.1 M fosfat tamponu (PBS, pH 7.4) ile retina sabitleyin.
7. 4 gecede 0,1 M PBS ile yıkayın ° C
8. Ertesi gün, tepki wi. 0.1M PBS streptavidin-Alexa 488 (son konsantrasyonu 10 mg / ml) +% 0.3 Triton X-100,% 2 ve 4 gecede tutmak ° C
9. 10 dakika her RT 0.1M PBS ile üç kez yıkayın
10. PBS, ince bir fırça kullanarak, retinaya sonra filtre kağıdı ayırmak ve bir slayt üzerine, retina, fotoreseptör-yüzü yukarı odaklı yerleştirin.
11. Yavaşça Vectashield montaj orta (Vector Laboratories, Burlingame, CA) ile monte edin.
12. Ölçüde, farklı deneysel koşullar (aydınlatma koşulları örneğin test ilaçlar) etkilerini karşılaştırmak böylece, deneysel her durum için aynı büyütme, çözünürlük ve ayarları konfokal mikroskobu (örneğin Zeiss 510 META) bir lazer tarama ile fotoğraf çekmek gap junction tracer kavrama (Şekil 2A-C ve Şekil 4A-C). Etiketli tüm hücreleri tek bir görüntü içeriyor olsa da, ilgi alanı z-yığını toplamak ve tek bir sözlük tavsiyegörüntü.

3. ImageJ kullanarak tracer kaplin Kantitasyonu

1. LSM görüntü tarayıcısı, görüntüyü açmak, İHRACAT tıklayın ve dosya sıkıştırıldığında sonuçlanır TIF-16 bit olarak resmi kaydedin. Ölçek çubuğu bu TIF resim dahil edilmelidir.
2. NIH ImageJ yazılımı kullanarak, tüm montaj retina düşük büyütmeli görüntü Alexa-488-etiketli neurobiotin floresan yoğunluğu ölçmek. ImageJ yazılımını kullanarak, TIF dosyası açın ve ölçek çubuğuna karşılık düz bir çizgi çizin. ANALİZ SCALE SET ve bilinen bir mesafe ve uzunluk birimi girin, sonra Tamam'ı tıklatın. Şimdi ölçüm sonuçları bu milimetre olarak kalibre üniteleri, sunulabilir.
3. Dikdörtgen seçim aracını kullanarak ilgi alanı seçin. Floresan tepe seçim sol sınırında yerleştirilmelidir. Sağ sınırına yakın bir floresan sinyal olmadığından emin olun. Aksi takdirde, aktif (RESİM, sonra ROTATE) döndürün.
4. TıklayınANALİZ ve PROFİLİ ARSA. , Soldan sağa doğru bir üstel bozulma ile bir eğri göreceksiniz.
5. Pop-up penceresi KOPYA tıklayın ve EXCEL yapıştırın. Şimdi mesafenin bir fonksiyonu olarak kesme kesme (sol sütun) ve floresan (sağ sütun) mesafe gösteren iki sütun bakın.
6. Maksimum floresans değeri göreli floresan yoğunluğu elde etmek için her çiğ floresan değeri bölün.
7. Sonra kesme (X) ve (Y) göreli floresan mesafe karşılık gelen ve Kopyala iki sütun Kökeni yazılım içine yapıştırın.
8. Üstel bozulma şeklinde # 1 fonksiyonu (Şekil 2D ve Şekil 4D), Fit:
   Y = Y ₀ + Y _max * exp ^{(-x / λ)}
   Burada Y göreli floresan, _Y o eşiğe, _Y max maksimum bağıl floresan, λ space (uzunluk) sabit ve x kesim mesafedir.
9. T-testi veya ANOVA (Şekil 2E ve Şekil. 4E) kullanarak farklı deneysel koşullar altında uzay sabiti (λ) değerleri karşılaştırın. Not nicelikleme alternatif teknikler, ^başkaları 13,14 tarafından tarif edilmiştir .

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 2 ve 3 (balık) ve Şekil 4 (tavşan) yükleme kesim tarafından belirlenen kaplin fotoreseptör hücre tracer Temsilcisi örnekler sunulmuştur. Konfokal görüntüler kesim mesafe bir fonksiyonu olarak çizilen ve yukarıdaki No 3.8 'de gösterildiği üstel fonksiyonu ile donatılmış karşılaştırma (Şekil 2A-C ve Şekil 4A-C) ve floresan yoğunluğu için aynı ayarları kullanarak alındı (Şekil 2D ve Şekil 4D). Uzay her bir durum için sabit değerlergap junction tracer kaplin ölçüde kesilmiş yükleme tekniği kullanılarak sayısal olabileceğini gösteren, 2E, 4E Rakamlarla gösterilmiştir. Buna ek olarak, yüksek oranda tekrarlanabilir sonuçlar. Gap junction tracer kaplin ölçüde nicel bir araç olarak yükleme kesim tekniği kullanın floresans şiddeti her durumda kesme mesafenin bir fonksiyonu olarak katlanarak azalır bulgu tarafından da doğrulanır ^(7,8 incelendiğinde de Şekil bakın. neurobiotin, diğer retina sitelerinden jilet kesim ve ile fotoreseptör girdiğinizi belirten 2D ve 4D) . Ayrıca, fotoreseptör hücre tracer kaplin niteliksel benzer gündüz / gece fark tek koniler tracer enjeksiyonları ile goldfish ve kesme yükleme ⁷ ile gözlenen fotoreseptör kaplin ölçüde ölçme nispeten doğru bir araç olarak kesilmiş yükleme çiziyor.

Kesme-lretinanın elektriksel sinaps diğer türlerini araştırmak için ukleniyor tekniği de kullanılabilir. Örneğin, Şekil 5, A-tipi (Şekil 5A) ve B tipi (Şekil 5B) yatay hücreler tracer kaplin homolog sergileyen bu tavşan göstermektedir aşağıdaki cut-yükleme ve koyu adapte koşullar altında neurobiotin yayılması .

Bileşik	Balık	Fare	Tavşan
NaCl	130	120	117
NaHCO 3	20	25	30
NaH 2 PO 4	-	1	0,5
KCL	2,5	5	3,1
Glikoz	10	10	10
MgCl 2	1	-	-
MgSO 4-7H 2 O	-	1	1,2
Glutamin	-	0,1	0,1
CaCl 2	0,7	2	2

Tablo 1: Zil çözümleri goldfish, fare ve tavşan retina Kompozisyon. Konsantrasyonlarda mM sunulmaktadır. Zil çözümleri kabarmış ve% 5 CO ₂ /% 95 O ₂ ile 22 ° C (balık) veya 36 ° C (memeliler) korunur. "-": Bu türler için Zil dahil değildir.

Şekil 1: cut-yükleme prosedürü gösteren akış şeması. İzolasyon o sonraf sağlam nöral retina, birkaç radyal ilk kez% 0.5 'lik neurobiotin çözeltisi batırılmış bir bıçak keser tarafından yapılmıştır. Retina tracer yükleme ve difüzyon inkübe ve sonra 0.1M fosfat tamponu (PB)% 4 paraformaldehid (PFA) ile tespit önce yıkandı. Tracer kaplin Alexa-488 streptavidin-konjuge kullanılarak incelenmiştir.

Şekil 2 goldfish fotoreseptör tracer kaplin gün-gece fark yükleme kesme tekniği ile ortaya çıkar. Fotoreseptör hücre gap junction neurobiotin tracer kaplin, kontrolü koşullar altında (A) gün içinde spiperone (10 mcM), seçici bir dopamin _{D 2} reseptör antagonisti (C) uygulaması sonrasında gece (B) ve gün içinde yoğun olduğunu, ancak . D) Normalize kesim mesafe (AC oklarla gösterilen) bir fonksiyonu olarak göreceli floresan yoğunluğu. E) Uzay sabit valD ve diğer deneyler (n = 4) veri elde ues. *** P <0.001.

Şekil 3 neurobiotin ve rodamin dekstran hem de bir çözüm ile kesme yükleme ertesi gece karanlık bir adapte goldfish retina fotoreseptör hücre tabakası floresans gösteren bir temsili örnek. Yüksek molekül ağırlıklı (> 10.000 MW), sadece kesme yakın etiketli hücreleri nedeniyle açık gap junction kanalları aracılığıyla diffüz değildir rodamin dekstran (kırmızı ile gösterilen). Buna karşılık, gap junction dağılmıştır neurobiotin (yeşil renkte) ve fotoreseptör hücrelerin kesim uzak görülebilir. Kesim yeri her panelinde ok ile belirtilir. Ölçek çubuğu: 200 mm.

Şekil 4 gün-gece farklı.tavşan retinada kaplin fotoreseptör tracer varlığı, kesme yükleme tekniği ile ortaya çıkar. Fotoreseptör hücre gap junction neurobiotin tracer kaplin, kontrolü koşullar altında (A) gün içinde spiperone (10 mcM) (C) uygulaması sonrasında gece (B) ve gün içinde yoğun olduğunu, ancak. AC, dik kesme yakın tavşan fotoreseptörlerin 3D rekonstrüksiyon kez gösterilmiştir. D) Normalize keser mesafenin bir fonksiyonu olarak göreceli floresan yoğunluğu. E) Uzay sabit değerler, D ve diğer deneyler (n = 3) verilerden elde edilmiştir. *** P <0.001.

Şekil 5 Kes yükleme koyu adapte tavşan yatay hücreler tracer birleştiğinde ortaya koymaktadır. A-tipi (A) ve B tipi (B) yatay koyu adapte tavşan retina hücreleri homolog neurobiotin tracer kaplin sergilenmektedir.

Tartışma

Burada açıklanan kesme yükleme yöntemi, gece ve gündüz farklı zamanlarda, farklı aydınlatma koşulları altında ve retinal nöronlar arasındaki boşluk kavşak tracer kaplin boyutunu belirlemek için kullanışlı ve basit bir tekniktir. Bu tekniğin avantajları arasında gece ve gündüz çeşitli aydınlatma koşulları altında sağlam retina dokusunda nöronlar arasındaki boşluğu kavşak tracer kaplin derecesini ölçmek için ve küçük çaplı somata birleştiğinde nöronlar için bunu yapmak için yeteneği dahil. Iki genel kategoriye ayrılır sağlam doku sonbaharda gap junction çalışma tekniği Sınırlamalar. İlk olarak, izli açık gap junction aracılığıyla difüzyon a) küçük çaplı ya da açık kanalları ve b) birleştiğinde hücresel bölmelerinin göreceli ^hacimleri 1,14,15 ile ilişkili ücret nedeniyle gözlemlemek için nispeten zor olabilir . Yani, küçük bir hücre birleştiğinde hücreleri daha büyük bir hücre ya da grup, comp tracer difüzyondaha büyük bir hücre daha küçük bir hücreye tracer difüzyon ared tracer seyreltme nedeniyle tespit etmek daha zor olabilir. İkincisi, bazı fizyolojik koşullar altında, sağlam doku gap junction tracer difüzyon yoluyla ölçüde doğru nispeten büyük tracer geçirgenliği ile karşılaştırıldığında, küçük bir elektrik akımı taşıyan iyonları iletkenliği farklılıklar nedeniyle boşluk junctional iletkenlik gücünü yansıtmıyor olabilir molekülleri ^1,14,15. Tracer kaplin kanıt, genel olarak, güçlü bir şekilde işleyen, açık gap junction kanalları varlığını önerir, ancak bazı fizyolojik koşullar altında, tracer difüzyon elektrofizyolojik kayıtlar işleyişi, açık gap junction varlığını düşündürmektedir bile oluşmaz ya da gözlenebilir.

Bu kesim yükleme tekniği, aynı zamanda merkezi sinir sistemi diğer bölgelerden gelen sağlam doku nöron arasındaki boşluğu kavşak tracer kaplin ölçüde araştırmak için kullanılabilir olması olası görünüyortem.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktifi Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Tricaine metan sülfonat (MS222)	Sigma-Aldrich	A5040	150 mg / L, tamponlu balık tank su
Üretan	Sigma-Aldrich	U2500	2 g / kgloading doz
Çift Tüp Gece Görüş Gözlüğü	Gece Optik ABD	D-221
Filtre Kağıdı, Sınıf No 4	Whatman	1004-090
Güzel Forseps, 11 cm uzunluğunda Dumont No: 5, biologie	Güzel Bilim Araçları	11295-10
Güzel Makas, yaylı, 8 mm bıçak, düz	Güzel Bilim Araçları	15025-10
Neurobiotin	Vektör	SP-1120	% 0.5
Streptavidin-konjuge Alexa 488	Invitrogen	S11223	% 2
Dekstran rodamin (yüksek (> 10.000) MW)	Invitrogen	D1817	% 0.5
Vectashield montaj orta	Vektör	H-1000
Zeiss 510 META Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop	Carl Zeiss, Inc.
LSM-5 Image Browser 3,2,0,115	Carl Zeiss, Inc.
ImageJ Yazılım	NIH
OriginPro 8.0	OriginLab Corp.