$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Künt diseksiyon: sabitlenmemiş örneklerinde fare göz Enükleasyon
- Maruz kalma ve posterior dünya (gözün) yüzey erişimi geliştirmek için göz kapaklarını açarak çekin.
- Yörüngede (altında) dünya (göz çukuru) arkasında eğik pansuman forcep yerleştirin. Mahajan Sharptip pansuman forcep (malzeme ve reaktiflerin tabloya bakınız) bu adımı kolaylaştırmak için sivri uçlu özel bir araçtır.
- Forcep kapatın ve dünya sıkma önlemek için dikkatli olmak ise dünyanın arkasında bağ dokusunda ve optik sinir kavramak.
- Yavaşça yukarı forcep çekin ve yörüngeden küresi koparmak. Beyaz iplik benzeri doku optik sinir olduğunu.
- PBS içinde göz yerleştirin. 30-gauge iğne kullanarak, tek bir delinme küresi içine iğne 1-2 mm takarak limbus hemen posteriorunda yara olun. Bu göz dokusuna nüfuz çekemeyen gibi glutaraldehit gibi fiksatif,, en doğrudan sağlarter göz. Bir sabitleştirici, örneğin paraformaldehit veya alkol gibi, ilgi göz dokusu içine difüzyon yeteneğine sahipse bu delme yara bölgesinin oluşturulması gerekli olmayabilir.
- Hemen daldırma fiksasyonu için fiksatif içine tüm göz yerleştirin.
2. Keskin Diseksiyon: fare gözü aşağıdaki perfüzyon fiksasyon Enükleasyon
- Uzakta dünyanın gelen göz kapağı tutmak için kavisli bir colibri forcep kullanın.
- Dünya paralel Orient kavisli Westcott diseksiyon makas, yörüngenin arkasına doğru hedeflerken.
- Inferior, medial, üstün, ve lateral taraftan dünya çevreleyen sabit bağ dokusu kesin.
- Dünyanın arkasındaki kavisli forcep yerleştirin, dünya üzerinde basmadan bağ dokusu tutun ve gözün enükleasyonu için ileriye doğru çekin. Orbital bağ doku perfüzyonunun tespit edildiği sert olduğu için, orbital doku ilave kesme topak tamamen serbest bırakmak için gerekli olabileceke.
3. Fiksasyon ve Paketleme
Sabit dokuların Nakliye uygun etiket ve ambalaj dahil olmak üzere kurumsal ve posta hizmet gereksinimleri takip etmelidir. Aşağıdaki protokol, ortam sıcaklığında bir enfeksiyöz olmayan biyolojik numune nakliye bir örnektir. Bu 3 ambalaj katmanları ama hiçbir A / B sınıfı biyolojik madde veya sıvı azot etiketleri gerektirir.
- Tespit kısa olması durumunda, en az 3 mL sabitleştirici, ya da post-sabitleştirici tampon ile 5 mililitrelik bir cam sintilasyon şişesi içine göz yerleştirin. Şişenin kapağı üzerinde takip numarasını yazın ve Parafilm ile kapayın.
- Biyolojik numune içine yerleştirin sintilasyon şişeleri koliyi onayladı. Örnek içine yerleştirildiği bir kapalı kap, bir emici orta tabaka ve bir dış koruyucu katman: Bu enstitü, örneğin, uygun kaplar üç tabaka gerektirir.
- Bir kabarcık şal paket içine ve sonra app içine bir kap yerleştirinuygun dokümantasyon ile birlikte roved laboratuar konteyner nakliye.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Gözlerin Histolojik incelemede Hematoksilen-Eozin boyama, enzimatik ifade algılama, transmisyon elektron mikroskobu ve immünhistokimya gibi çeşitli yöntemler ile gerçekleştirilebilir. % 4 paraformaldehid immersiyon fiksasyon sonrasında doku parafin ve mikrotom üzerinde kesit içinde gömülü idi. Yüksek verimli fenotipleme, biz öğrenci-optik sinir bölümleri analiz, göz örnek tüm doku tipleri (Şekil 1). Doku bölümleri de lacZ ifade (Şekil 2), hücresel organel transmisyon elektron mikroskobu (Şekil 3) ve antikorlar (Şekil 4) ile spesifik moleküllerin ekspresyonu incelendi.
Bizim fenotipi tarama yöntemi olarak, (Latera nazal göre (medial canthus) ve zamansal ile gözün yönünü korumak için önemli değildil canthus) taraf. Göz yönelimi gerekli ise en az iki seçenek vardır. Enükleasyon sonra, bir el koter cihazı ile üç pozisyonunda temporal korneaya ışık koter uygulamış. Lezyon histoloji açıktır ve histolojik mürekkepler gibi işleme sırasında kaybolmak yok. Downside koter zararlardan muayene için kritik bir doku olabilir kornea olduğunu. Diğer seçenek ekstraoküler kas eklemeleri belirleyebilir yetenekli bir anatomist gerektirir. Stereomikroskopta altında, inferior ve superior oblik kas ekleme belirlenmesi dünyanın inferior ve superior ve yönü işaretler. 3. Her iki yönelim yöntemi ile, bir gözün sağ veya sol olarak numune izlemek için önemlidir. Birlikte, bu kesit öncesinde tam küre yönelim sağlayacaktır.
Şekil 1. Fare göz histolojik görüntüler afte r uzaktan edinimi. Fare gözler% 4 paraformaldehit ile perfüzyon fiksasyon izleyerek keskin diseksiyon ile iki parçaya ayrıldı. Hematoksilen ve eosin ile boyandı A. Öğrenci-optik sinir bölümünde tüm doku altyapılar korunması gösterir. Optik sinir, ON. ; IPL, iç pleksiform tabaka; INL, iç nükleer tabakada; OPL, dış pleksiform tabaka; onl, dış RGC, retina ganglion hücrelerinin: Normal retina (yeşil ölçek çubuğu = 500 mikron) B. Daha yüksek bir büyütme ile laminar yapısını gösterir nükleer tabaka (fotoreseptör hücre) (ok); OS, fotoreseptör dış segmentleri;; RPE, retina pigment epiteli, C, koroid, fotoreseptör iç segment (ok başı) IS. (Yeşil ölçek bar = 50 mikron) C. Normal retina ile karşılaştırıldığında, bu numune fotoreseptör dejenerasyonu için tiner kaynaklanmaktadır. Onl, IS ve OS (ok) tamamen bulunmaz. (Yeşil ölçek bar = 50 mikron)
"Alt =" Şekil 2 "/>
Transgenik farelerde Şekil 2. LacZ ekspresyonu. Gözler (5 mM K3Fe (CN) 6, 5 mM K4Fe (CN) 6, 2 mM MgCl2,% 0.02 NP40 diseksiyon ile çıkarıldı ve 1 mg / ml X-gal çözelti içerisinde bekletilmiştir , 37 geceleme ve% 0,1 sodyum deoksikolatın) ° C Gözler 30 dakika ve bir mikrotom üzerinde kesit için% 2 formaldehyde/0.2% gluteraldehit ile tespit edildi. X-gal ürün (mavi) etiketler: A. Silier epiteli, B. kornea epitel ve C retina retina ganglion hücre (RGC) katmanı. INL, iç nükleer tabakada; onl, dış nükleer tabaka.
Şekil 3,. Retina pigment epiteli (RPE) Transmisyon elektron mikroskobu. Bir delinme yara künt diseksiyon ve yaratıldıktan sonra, gözleri daldırma vardı 0.1M sodyum fosfat tamponlu% 2.5 lik Paraformaldehyde /% 2.5 glutaraldehit ile tespit edildi. Gözler secon edildidarily,% 1 osmiyum textroxide sabit giderek susuz ve Spurr en reçine gömülü. Doku 90 nm'de kesitli ve Formvar kaplı bakır yuvası ızgaralar üzerine yerleştirilir ve bir transmisyon elektron mikroskobu ile görüntülendi. Mikrografı, fotoreseptör dış nörosensöriyel retinanın kesimleri, retina pigment epiteli içindeki melanozom (M) ve Bruch membranı gösterir.
Şekil 4. Fare vitreusta süperoksit dismutaz-3 immünhistokimyasal etiketleme (yeşil). Gözler künt diseksiyon ile çıkarıldı ve% 4 paraformaldehid daldırma fiksasyon uygulandı. Onlar mikrotom kullanılarak parafin ve kesitli gömüldü. 01:50 seyreltilmiş Doku kesitleri tavşan poliklonal SOD3 antiserum ile inkübe edildi. SOD3 ifade keçi anti-tavşan IgG (H + L)-Alexa Fluor 488 konjuge sekonder antikor ile tespit edildi. SOD3 Etiketlenmesi gre gösterilirtr.