Kombine İlaç İnfüzyonu ve Elektrofizyolojisi için Mikroakışkan Tabanlı Mikroinjectrode Sistemi

Özet

Kaynak: Vanegas, M. I., et al. Kombine İlaç İnfüzyonu ve Elektrofizyolojisi için Mikroinjectrode Sistemi. J. Vis. Uzm. (2019)

Bu videoda, hassas hacim takibi için yağ bazlı bir işaretleyici solüsyon kullanan ve eş zamanlı nöral kayıt ve ilaç infüzyonu sağlayan bir kılcal tüp aracılığıyla ilaç solüsyonu sağlayan mikroelektrot tabanlı bir mikroakışkan cihaz gösterilmektedir.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

1. Stimülasyon ve Kayıt için Mikroinjectrode Yapımı (Şekil 1a)

1. Kanülün ve probun uzunluğunu ölçün (bu örnekte bir nanosensör). Prob, kanül ucundan çıkacağı uzunluk (prob tasarımına bağlı olarak) ve yaklaşık 2 cm kadar kanülden daha uzun olmalıdır.
2. Bir büyüteç veya mikroskop altında (~ 10x büyütme), probu kanüle yükleyin; mümkünse probun ucunu korumak için geri yükleme tercih edilir.
   NOT: Manuel olarak gerçekleştirilen bu adım zordur. Gerçek bir deneysel prob ile denemeden önce büyüteç altında bir mikroelektrot ile pratik yapmanız önerilir.
3. Kanülü (probu içeren) üst yüksük, T-bağlantısı ve alt yüksükten geçirin.
   1. Prob herhangi bir eki olmayan tek bir kabloysa, onu kanüle geri yükleyin ve düzeneği alt yüksükten T-bağlantısına yerleştirin. Kanülün üst kısmı (düz uçlu taraf), T bağlantısının ortasına, alt kısma yerleştirilmeli, ancak üst yüksük içine yerleştirilmemelidir. Deneysel prob veya biyosensör, yüksüğün üst kısmının üzerinde çıkıntı yapmalıdır.
      NOT: Özel yapım yüksükler, mikro matkap uçları kullanılarak yüksük tapalarında bir delik açılarak da yapılabilir, deliğin boyutu, kanülü T-bağlantısına sıkmak için gereken çapa bağlıdır.
4. T bağlantısının üstündeki ve altındaki yüksükleri sıkmak için yüksük anahtarını kullanın. Aşırı sıkmayın. Üst yüksük içindeki elektrot desteğini güçlendirmek için küçük bir boru parçası eklenebilir.
5. Probun özelliklerine göre prob terminallerinin her birine (sinyal, toprak vb.) altın pimler lehimleyin.
6. Prob ve kanülün göreceli konumunu ayarlayın. Probun büyütme altında kanülden çıkıntı yaptığı mesafeyi ölçün ve üst uçtan manuel olarak ayarlayın (prob yüksükler içinde serbestçe kayabilir).
7. Probu yüksüğe takmak için altın pimler ile üst yüksük arasına epoksi yapıştırıcı ekleyin.
8. Kanül içindeki probu geri çekmek için üst yüksüğü sökün. Probun büyütme altında tamamen kanül içinde olduğunu görsel olarak onaylayın.
9. Enjeksiyonu mikro sürücüye takın.

2. İlaç İnfüzyonu için Mikroinjectrode Yapısı (Şekil 1b)

1. Kanülün "eğimsiz" veya düz ucunu bir yüksük kullanarak T-bağlantısının altına takın. Yüksüğü sıkmak için yüksük anahtarını kullanın.
2. Standart yüksükten geçirerek T bağlantısının üstüne küçük bir kılcal boru parçası (~ 1.5 cm) takın. Bir yüksük anahtarıyla sıkın.
3. Mikroelektrodu kılcal boru, T-bağlantısı, kanül ve ilgili yüksüklerden geri yükleyin.
4. Elektrotun arka ucunun, kılcal borunun arkasından 1 cm'den daha az çıkıntı yaptığından ve elektrotun ucunun kanülden alt tarafta istenen mesafede çıkıntı yaptığından emin olun. Elektrot konumu üst uçtan manuel olarak ayarlanabilir.
5. Mikroelektrot terminaline altın bir pim lehimleyin.
6. Mikroelektrodu yüksüğe takmak için altın pim ile üst yüksük arasına epoksi yapıştırıcı ekleyin.
7. Kanül içindeki probu geri çekmek için üst yüksüğü sökün. Mikroelektrotun kanüle tamamen geri çekildiğini görsel olarak onaylayın.

3. Mikroakışkan Devresinin Yapısı (Şekil 2)Sabit

1. bir yüzeye bir devre tahtası yerleştirin. İki üç vanayı, devre tahtasının en uzun kenarlarına paralel olarak, yaklaşık 6 inç yerleştirin. ayrı, bir bağlantı noktası (her zaman açık olan) birbirine bakacak şekilde. Valfleri devre tahtasına sabitlemek için vidaları kullanın.
2. Valflerin yanına bir cetvel yerleştirin (kılcal boru içindeki sıvıların hareketini ölçmek ve izlemek için).
3. Gaz geçirmez şırıngaya 1:1 oranında düşük viskoziteli yağ ve gıda boyası (işaretleyici) karışımı yükleyin ve Marker pompasına yerleştirin. Bir parça kılcal boruyu kesin ve şırıngayı Giriş valfindeki bağlantı noktalarından birine bağlamak için standart yüksükler ve Luer kilitli konektörler kullanın. Bu "işaret çizgisi" dir.
4. "Cetvel çizgisi" için kısa bir kılcal boru parçası kesin. Valflerin bakan portlarına sıkmak için standart yüksükler kullanın.
5. Çıkış valfini mikroinjectrode'a bağlamak ve İlaç pompasını Giriş valfine bağlamak için iki uzun kılcal boru parçası kesin (standart yüksükler kullanın).
   NOT: Bu iki hattın uzunluğu deney düzeneğine bağlıdır, biri infüzyon aparatından hayvana, diğeri ise İlaç pompasından Giriş valfine ulaşacak kadar uzun olmalıdır. Kılcal boruyu kesmek için bir yarma taşı kullanın.

4. Microinjectrode'un Microdrive'a Takılması (Şekil 3)

1. Montajdan önce mikroelektrotun/deney probunun kanülde geri çekildiğinden emin olun.
   NOT: Kılavuz tüp, mikro sürücüde bir konumda olmalıdır.
2. Mikroinjectrode'a özel yapım bir adaptör takın.
3. Mikroinjectrode'u kılavuz tüpten üstten yükleyin ve vidaları kullanarak adaptöre sabitleyin.
4. Mikroinjectrode'un kılavuz tüpten çıkıntı yaptığı mikro sürücü konumunu (derinliğini) ölçün, ardından yerleştirmeye hazırlanmak için ~1 cm geri çekin.
5. Mikroinfüzyon deneyleri için, "beyin hattını" mikroelektrotun kullanılmayan T-bağlantı açıklığına bağlayın. Standart bir yüksük kullanın ve bir yüksük anahtarıyla sıkın.

5. Mikroakışkan Sistemin Yıkanması ve Hazırlanması

1. Mikrosürücüyü mikroinjectrode ile birlikte bir atık kabının üzerine yerleştirin.
2. Klorheksidin (örneğin, 20 g / L'de çözülmüş nolvasan) 1 mL gaz geçirmez şırıngaya yükleyin ve İlaç pompasına yerleştirin. Valflerin akış yönünü, sıvının İlaç pompasından valf aracılığıyla valf hattına ve "beyin hattından" çıkacağı şekilde çevirin.
3. Devreyi en az 10 dakika boyunca düşük bir akış hızı (50-200 μL/dak) kullanarak klorheksidin ile yıkayın. 5.2'den 5.3'e kadar olan adımları steril tuzlu su ve ardından hava ile tekrarlayın.
   NOT: Bu aşamada sızıntı olup olmadığını kontrol etmek önemlidir. Yüksüklerden herhangi bir sıvı sızıntısını ortaya çıkarmaya yardımcı olmak için bağlantı noktalarına nazikçe tüy bırakmayan mendiller uygulayın.
4. İlacı 500 μL'lik gaz geçirmez şırıngaya yükleyin, havayı sıkıştırın ve ardından İlaç pompasına yerleştirin. Mikroinjectroddan birkaç damla akana kadar 50 μL / dk'da akın.
5. Kılavuz tüpü 15 dakika klorheksidin (20 g / L'de çözülmüş) içinde bekletin.
6. Çıkış vanasının yönünü "yıkama hattına" doğru çevirin. Cetvel çizgisinde net bir renk ve yağ kenarı görülene kadar İşaretleyici pompasını ilerletin. Suda çözünür iki malzemeyi karıştırmamak ve aralarındaki keskin kenarı kaybetmemek için ilaç ile renk arasında her zaman yağ olduğundan emin olun. Bu yağ/boya hattının başlangıç konumunu işaretleyin (bir parça bant veya işaretleyici ile).
7. Çıkış valfinin yönünü beyin hattına doğru çevirin.

6. Kayıt veya İnfüzyon Deneyi Yapılması

NOT: Hayvanlarla başa çıkma adımları laboratuvara ve deneye bağlı olarak değişecektir. Durayı ortaya çıkarmak için gerekli cerrahi kurulum ve hazırlıktan sonra aşağıdaki adımlar gerçekleştirilmelidir. Deneyi takiben, gerekli tüm işlem sonrası adımlar kurumsal olarak onaylanmış protokollere uygun olarak gerçekleştirilmelidir.

1. Mikro sürücüyü kayıt odasına takın. Dura'ya nüfuz etmek için kılavuz tüpü indirin.
   NOT: Kortekse zarar vermemek için kılavuz tüp duradan daha fazla nüfuz etmemelidir.
2. Beyinde kayıt / enjeksiyon için mikroinjectrode'u bölgenin yaklaşık 2 mm yukarısına indirin.
3. Üst yüksüğü (çıkıntılı mikroelektrot/biyosensör) sıkın ve altın pimleri kayıt sistemine bağlayın. Mikroinjectrode'u hedef bölgeye ilerletmeye devam edin.
   NOT: Hesaplamalara mikroelektrotun kanülün ötesine uzandığı mesafeyi dahil etmeyi unutmayın.
4. İnfüzyon deneyleri için, yağ sütununu her 3 dakikada bir (~ 60 nL / dak) 1 cm hareket ettirmek için manuel mikroşırınga pompasını kullanın. İstenen hacim infüze edildikten sonra, Çıkış valfini yıkama hattına doğru çevirin.
   NOT: İnfüzyona uğrayan hacim, model türüne ve hedeflenen beyin alanına göre değişecektir. Daha hızlı akış hızları nöral dokuya zarar verebilir.
5. Deneyler tamamlandığında, kılavuz tüp içindeki mikroinjectrode'u geri çekin (probu çıkıntılı bırakın). Ardından yıkama için mikro sürücüyü çıkarın. Yeniden kullanıma hazırlamak için mikroakışkan sistemi yıkayın. not: Deneyimlerimize göre, uygun bakım yapılırsa mikroinjectrode birkaç kullanım için sürecektir. Elektrofizyolojik kayıt kalitesi, enjeksiyon kapasitesinden daha hızlı düşer.

Sonuçlar

Şekil 1: Mikroinjectrode'un adım adım üretimi. (bir) Mikroakışkan sistemden bağımsız kullanım için konfigürasyon. Kanül ve prob, probun ucunun istenen uzunlukta (örn. 150 μm) çıkıntı yapabileceğini doğrulamak için ölçülür. Pr...

Malzemeler

https://products.labsmith.com/standard-breadboard/#.XO8xDdNKh24 Steril salin (sodyum klorür) %0,9. https://www.fishersci.com/shop/products/emd-millipore-millex-sterile-syringe-filters-pes-membrane-green-4/slgpm33rshttps://products.labsmith.com/interconnect-tee#.XO8z8dNKh24

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
3 manuel valfler	LabSmith	Manuel 3 Seçici Vana (MV201-C360)	https://products.labsmith.com/mv201-manual-3-port-selector-valve/#.XNYEC9NKh26
Kanül	Vita İğne Şirketi	304 Paslanmaz çelik boru, Dış Çap 228μm, İç Çap 165μm	https://www.vitaneedle.com/assets/files/Vita_Needle_Master_Tubing_Gauge_Chart.pdf
Yarma taşı	Molex	Yarma taşı 1" x 1" (parça No. 1068680064)	Kılcal boruları parçalamak için izlenen yöntemin izlenmesi şiddetle tavsiye edilir: https://www.cmscientific.com/info_sheets/cleaving_procedure.pdf
Clorhexidine diasetat	Walmart	Nolvasan solüsyonu dezenfektanı (AAP311)	Mikroakışkan devre yıkama için kullanılır, 20 g / L'de çözülür
Özel adaptör	Özel		sağlayıcı-Mikroinjectrode'u hidrolik mikro sürücüye bağlamak için özel işlenmiş adaptör
Sürücü	Breadboard	vidalarını takmak için LabSmith T7 TORX sürücüsü (LS-TORX Sürücüsü)	https://products.labsmith.com/ls-torx-driver/#.XO8sndNKh25
Epoksi yapıştırıcı	LabSmith	Metal ve plastik yapıştırma için iki parçalı yüksek mukavemetli epoksi yapıştırıcı (LS-EPOXY)	https://products.labsmith.com/ls-epoxy-12ml-epoxy-adhesive/#.XO8t89NKh24
Yüksük	LabSmith	Tek Parça Bağlantı Elemanı (C360-100), 360μm OD kılcal	https://products.labsmith.com/one-piece-fitting#.XNYEaNNKh24
Yüksük fişi	LabSmith	Tek Parça Fiş (C360-101) herhangi bir -C360 bağlantı noktasında	kullanım içinhttps://products.labsmith.com/one-piece-fitting-plug/#.XNYFl9NKh24
Yüksük anahtarı	LabSmith	Tek parça bağlantı parçaları ve tapaları takmak için 1/8" altıgen anahtar (LS-HEX 1/8" Altıgen Anahtar)
Gaz geçirmez şırınga	Hamilton Company	500μL gaz geçirmez şırınga modeli 1750 (81220) ve 1 mL gaz geçirmez şırınga modeli 1001 (81320)	https://www.hamiltoncompany.com/laboratory-products/syringes/81220#top
Altın pimler	Aim-Cambridge	Erkek altın kaplama kıvrımlı konektör pimi (40-9856M)	https://www.masterelectronics.com/aim-cambridge-cinch-connectivity-solutions/409856m-10109145.html
Tüy bırakmayan mendiller	Kimberly Clark	Kimtech Science Kimwipes Hassas Görev Sistemdeki	sızıntıları belirlemek için kullanılan tüy bırakmayan mendiller
Sıvı gıda boyası	McCormick & Co.	Su bazlı, siyah sıvı gıda boyası (52100581873)	https://www.mccormick.com/spices-and-flavors/extracts-and-food-colors/food-colors/black-food-color
Düşük viskoziteli yağ	Clearco Products Co.	25 ° C'de 1cSt viskoziteli Saf Silikon Sıvısı Oktametiltrisiloksan (PSF-1cSt)	http://www.clearcoproducts.com/pure-silicone-super-low-viscosity.html
Luer-Lock konektörü	LabSmith	Luer-Lock Adaptörü (C360-300), Luer Lock şırıngasını 360μm kılcal boruya	bağlamak için dişi bağlantı parçasıhttps://products.labsmith.com/luer-lock-adapter-assembly#.XO81MtNKh24
Mikro matkap uçları	Grainger	Mikro matkap ucu, 0,23 mm (414H85)	https://www.grainger.com/category/machining/drilling-and-holemaking/drill-bits/machining-drill-bits/micro-drill-bits
Mikroelektrot	FHC	Metal mikroelektrot, epoksi izolasyonlu	tungstenhttps://www.fh-co.com/category/metal-microelectrodes
Yağ hidrolik mikromanipülatörü	Narishige Grubu	Kılavuz tüp takılı yağ hidrolik mikromanipülatörü (MO-96)	http://products.narishige-group.com/group1/MO-96/chronic/english.html
Polymicro Kılcal Boru	Molex	Polymicro Esnek Sigortalı Silika Kılcal Boru (TSP150375), Dış Çap 375μm, İç Çap 150μm	https://www.molex.com/webdocs/datasheets/pdf/en-us/1068150024_CAPILLARY_TUBING.pdf
Programlanabilir şırınga pompası	Harvard Aparatı	Standart İnfüzyon/Çekme Pompası, programlanabilir (70-2213)
Cetvel	İmparatorluğu	Paslanmaz çelik 6" Sert cetvel (27303)	http://www.empirelevel.com/rulers.php
Vida seti	LabSmith	Valf montaj vida seti (LS-VİDALAR .25), valfleri devre tahtasına monte etmek için diş oluşturan vidalar (2-28 x 1/4")	https://products.labsmith.com/ls-screws-25#.XO8widNKh24
Standart Breadboard	LabSmith	4" x 6" platform (LS600), sıvı devresini monte etmek için 0,25" delik aralığına sahip
	Baxter	% 0.9 Sodyum Klorür steril	İntravenöz İntravenöz İnfüzyon
Steril şırınga filtreleri	Millipore Sigma	MilliporeSigma™ Millex-GP™ PES Membranlı Steril Şırınga Filtreleri (SLGPM33RS)
Çalmak manuel mikroşırınga pompası	Çalmak Şirketi	El Kitabı infüzyon/çekme pompası (51222)	https://www.stoeltingco.com/manual-infusion-withdrawal-pump-2649.html
T-bağlantı	LabSmith	360μm OD kılcal boru ile kullanım için akış akışlarını birleştirmek için ara bağlantı tee (C360-203),

https://products.labsmith.com/ls-hex-1-8-hex-wrench/#.XO8sqtNKh24 https://www.harvardapparatus.com/standard-infuse-withdraw-pump-11-pico-plus-elite-programmable-syringe-pump.html