Burada, son derece aktif Hsp104 hexameric AAA + protein mayası, protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi arıtma için bir protokol açıklar. Bu düzeni yakınlık arıtma için His6 etiketli inşa patlatır E. coli Anyon-değiştirici kromatografi, TEV proteaz His6-tag kaldırılması, ve boyut dışlama kromatografisi izledi.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase
Bu makalede
Özet
Özet
Hsp104 maya hexameric bir AAA + protein 1, 2-10 protein ayrıştırılmasıyla çiftler ATP hidrolizi (Şekil 1). Bu etkinlik iki anahtar seçici avantaj kazandırır. Birincisi, Hsp104 tarafından düzensiz agrega Yeniden doğallaştırmanın ısı şok 3,5,11,12 dahil olmak üzere, çeşitli protein misfolding gerilmeler sonra maya hayatta kalma güçlendirir. İkincisi, Hsp104 çapraz beta amiloid fibriller itilme, sayısız yarar sağlayan bir rezervuar olarak prion (enfeksiyöz amiloidleri) yararlanmak ve 13-22 fenotipik varyasyon kalıtsal maya sağlar . Enteresandır ki, Hsp104 doğrudan maya prion proteinlerin Sup35 ve Ure2 23-30 oluşan olanlar da dahil olmak üzere preamyloid oligomerler ve amiloid fibriller remodels. Bu amiloid remodeling işlevselliği maya Hsp104 özel bir yönüdür. E. coli orthologue, ClpB, yeni model preamyloid oligomerler veya amiloid fibriller 26,31,32 başarısız olur.
Hsp104 orthologues hayvanlar, perplexingly dışında yaşamın tüm krallıkları bulundu. Gerçekten de, hayvan hücrelerinde herhangi bir enzim sistemine sahip olmadığını Yeniden doğallaştırmanın (yerine bozulması daha) çiftler protein ayrıştırılmasıyla bilinmeyen 33-35 kalır . Bu nedenle, biz ve diğerleri Hsp104 toksik preamyloid oligomerler ve amiloid fibriller 4,7,23,36-38 spesifik proteinlerin misfolding bağlı çeşitli nörodejeneratif hastalıklar için tedavi edici bir ajan olarak gelişmiş olabilir önerdi. Bu hastalıklar ile ilişkili toplanan türlerin doğrudan hedef tedaviler vardır. Ancak, Hsp104, Parkinson Hastalığı 23 gibi PrP 39 amiloid formları ile bağlı alfa-sinüklein oluşan toksik oligomerler ve amiloid fibriller çözünür . Daha da önemlisi, Hsp104 protein agregasyonunu azaltır ve Parkinson Hastalığı 23 ve Huntington hastalığı 38 kemirgen modellerinde nörodejenerasyon düzelir. İdeal olarak, tedavi optimize etmek ve yan etkileri en aza indirmek için, Hsp104 mühendislik ve seçici soru 4,7 hastalığın merkezi özel agrega bozulmasina potansiyelize olacaktır . Ancak, nasıl Hsp104 disaggregates sınırlı yapısal ve mekanik bir anlayış toplanan yapıları ve ilgisiz proteinler gibi farklı bir repertuar bu çalışmaların 30,40-42 köstekliyor .
Hsp104 yapısı ve mekanizması anlamak için, saf protein ve sulandırmak, disaggregase aktivite minimal bileşenleri ile çalışmak için gerekli. Hsp104 ~ 5.3, ADP ve ATP varlığında veya yokluğunda 43-46 nükleotid yüksek protein konsantrasyonları hexamerizes pI 102kDa proteindir. Burada, son derece aktif, istikrarlı Hsp104 E. temizleme için optimize edilmiş bir protokol tarif coli. E. coli basitleştirilmiş büyük ölçekli üretim sağlar ve yöntemi çok sayıda Hsp104 varyantları için hızlı ve güvenilir bir şekilde yapılabilir. Bizim protokol Hsp104 saflığı artar ve E. önceki bir arıtma yöntemi ile karşılaştırıldığında, O'nun 6-tag çıkarma işlemlerini basitleştiriyor coli, 47. Ayrıca, bizim protokol iki daha yeni protokoller 26,48 daha bayağı ve rahat.
Protokol
1. Hsp104, Açıklanması
- Plazmid E. arıtma için istihdam coli, pPROEX-HTB-Hsp104, trc organizatörü 26 indüklenebilir kontrol altında Hsp104 açık okuma çerçevesi içerir. Plazmid TEV proteaz bölünme tarafından kaldırılabilir bir N-terminal Onun 6-etiket Hsp104 üretir. Kodon optimize edilmiş E. içine pPROEX-HTB-Hsp104 Dönüşümü tipik bir bakteriyel dönüşüm prosedürü kullanarak coli BL21-CodonPlus RIL hücreleri (Stratagene, Agilent Technologies) (örneğin, üreticinin talimatlarına göre). Kodon optimize edilmiş E. kullanmak önemlidir. Hsp104 alışılmadık bir kodon önyargı çünkü coli....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Zaman Çizelgesi: maksimum Hsp104 aktivite için tüm arıtma düzeni mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tamamlanmış olması tavsiye edilir . Ancak, arıtma adımları her zaman pratik olmayabilir zorlu bir program yapar. Saflaştırma adımları en kısa sürede yapılması durumunda, 30 inkübasyon 2-4 saat gece ifade sonundan itibaren zaman ° C TEV proteaz ile yaklaşık 9-11 saattir. Duraklatmak için potansiyel bir yer TEV bölünme adım takip ediyor. Kesinlikle gerekli ise, Hsp104 ek bileşenini (Adım 5.2) Yukarıda açıklandığı gib.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH (5T32GM008275 22) ve Amerikan Kalp Derneği (EAS) predoctoral dostluk bir hibe ile desteklenen; Kimya-Biyoloji Arabirimi NIH (2T32GM071339-06A1) (MED) Bursu; ve hibe NIH (1DP2OD002177-01 ve NS067354-0110), Ellison Tıp Vakfı ve Bill ve Melinda Gates Vakfı (JS).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifin Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| BL21-CodonPlus-RIL Yetkili Hücreler | Stratagene, Agilent Technologies | 230255 | |
| 2XYT suyu | USB | 75864 | |
| Eksiksiz, minivan, EDTA içermeyen proteaz inhibitörü tabletler | Roche | 1836170 | |
| Pepstatin A | Sigma | P4265 | |
| Ni-sepharose 6 Hızlı Akış | GE Healthcare | 17-5318-02 | |
| Amicon Ultra-15 santrifüj filtre üniteleri (MWCO 30.000) | Millipore | UFC903008 | |
| Kaynak Q - 6ml sütun | GE Healthcare | 17-1179-01 | |
| proTEV Proteaz | Promega | V6052 | |
| AcTEV Proteaz | Invitrogen | 12575015 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare | 17-5172-01 | |
| Hsp40 | Testi Tasarımlar | SPP-400 | |
| Hsp72 | Testi Tasarımlar | ADI-NSP-555 |
Kaynaklar
- Erzberger, J. P., Berger, J. M. Evolutionary relationships and structural mechanisms of AAA+ proteins. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 35, 93-114 (2006).
- Glover, J. R., Lindquist, S. Hsp104, Hsp70, and Hsp40: A Novel Chaperone System th....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
