Süreksiz Percoll Sakkaroz Yoğunluk Gradient kullanarak Fare Cortex Synaptoneurosomes hazırlanması

Summary

Fare beyin korteksi translationally etkin, sağlam synaptoneurosomes (SNS) hazırlamak için bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, aktif SNS hızlı hazırlanması için izin veren bir süreksiz Percoll sakaroz yoğunluk gradiyenti kullanır.

Abstract

Synaptoneurosomes (SNS) fare beyin korteksi homojenizasyon ve bölümleme sonra elde edilir. Bunlar kortikal doku homojenize akson terminalleri kurtulmak vezikül veya izole terminalleri kapatılmalı. SNS sinaptik iletim çalışmasında faydalı kılan, pre-ve postsinaptik özelliklerini korurlar. Nöronal sinyal kullanılan moleküler makine korumak ve alımı, depolama ve nörotransmitterlerin salınımı yeteneğine sahiptir.

Aktif SNS üretim ve izolasyon sitotoksik ve SNS mekanik hasar nedeniyle düşük aktivite neden olabilir, yüksek yoğunluklu ve filtrasyon ve santrifüj yöntemleri nedeniyle genişletilmiş santrifüj gerektirebilir Ficoll gibi sorunlu kullanarak medias olabilir. Ancak, süreksiz Percoll sakaroz yoğunluğu gradyanlar SNS izole etmek için kullanmak translationally aktif SNS iyi verim üretmek için hızlı bir yöntem sağlar. Percoll sukroz gradient yöntemi, hızlı ve nazik bir pelet SNS ve mekanik hasara neden olduğu, izotonik koşullar istihdam ve daha az ve daha kısa santrifüj spin santrifüj adımları önler.

Protocol

1. Hazırlıklar ^1-4

1. 50 ml 2.5 M sakkaroz bulamaç karıştırılarak 500 mL (GM), degrade orta tampon hazırlayın, 1M Tris-HCl, pH7.5 hisse senedi ve 0,5 m EDTA 0.1 ml 2.5 ml, pH 8.0, stok Mili S su hacmi. Çözümü, kısım ve mağaza dondurulmuş sterilize edin Filtre.
2. Mili-Q H ₂ O. 1 mM çözüm yaparak tetrodotoxin (TTX) 1000x stok hazırlayın TTX alikotları -20 ° C'de saklanabilir
3. Mili Q suyu 100 mM Tris (pH 7.5), 5 mM Na ₂ HPO _4, 4 mM KH ₂ PO _4, 40 mM NaHCO ₃ ve 800 mM NaCl çözeltisi yaparak 10x Uyarım Tampon hazırlayın. Stok 4 saklanabilir ° C
4. Pre-cool santrifüjler için 4 ° C
5. Mili Q suyu 2.5 M sakkaroz (2 ml) 1 hacim Percoll (18 ml) 9 hacim ekleme Isosmotic Percoll (SIP) stok solüsyonu hazırlayın ve iyice karıştırın.
6. GM tampon SIP ilgili tutarların eklenmesi ve her karıştırma 3, 10, 15, ve% 23 degrade katmanları hazırlayın:

7. P1000 Gilson Pipetman kullanarak kapaklar Beckman santrifüj tüplerine 2 ml 23, 15, 10, ve% 3 isosmotic Percoll çözümleri pipetleme degrade katmanları dökün. Katmanlar arasında arayüz katmanları hiçbir karıştırma ile açıkça ayırt edilebilir olmalıdır. Gradyanlar kullanmadan önce en az 20 dakika süreyle 4 ° C'de saklayın. Gradyanlar aynı gün kullanılması tavsiye edilir rağmen 24 saate kadar saklanabilir. [Deneyimsiz laboratuvar personeli mavi boya katmanı arayüzleri görünüm için isomotic Percoll çözümler ekleyerek hazırlanıyor gradyanlar pratik.]

2. Fare diseksiyonu ¹

1. Tüm fare hayvancılık ve ötenazi prosedürleri NIH ve Üniversite kurallarına uygun olarak yapılır emin olun. Karbondioksit boğulma ya da hayvan protokolü olarak onaylanmış bir yöntem ile yavrular (yaş P13 P21) Euthanize.
2. Diseksiyonu kuruluna fare Pin ve etanol ile boyun ve baş arkasında sprey. Kafatası tabanında omurilik kesti keskin bir makas kullanarak, kafatasının üst deri kaldırmak parietal kemik ve interparietal kemik arasında veya beyin ve korteks bölgelerinde arasındaki yanal kafatası kesmek. Sonra burun tabanı (sagital sütür boyunca) kafatasının kesilmiş, dikkatle yumuşak parietal kemik tarafında her yarımkürede çekerek çıkarın ve bir spatula ile korteks kaldırmak. Spatula beyincik Yukarıdaki beyin içine takın ve daha sonra korteks kepçe ve buz GM tampon yerleştirmek. Homojenizasyon adıma hemen geçin. Korteks bu SNS oluşumunu olumsuz etkileyecek, çok uzun süre buz tampon oturmak izin vermeyin.

3. Homojenat ve SNS ^1-4 hazırlanması

1. Buz GM tampon korteks yıkayın ve soğuk GM tampon 5 ml içeren bir cam Dounce homojenizatör iki korteks transferi.
2. Yavaşça gevşek havaneli 5-10 vuruş ile korteks homojenize (havaneli "A"), 5-10 vuruş sıkı havaneli (havaneli "B") izledi. Darbeleri hızlı ama hava kabarcıkları neden yeterince yavaş olmalıdır. Programı 1 homojenizasyon sonra Homojenat bir resim. Vuruş sayısı, bireysel Homojenizatör ve beraberindeki havan bağlı olarak değişecektir. Gradyanlar vuruş sayısı değilse, güçlü bir SN band verdiği ayarlamanız gerekir bitirdi.
3. 4 15 ml konik ve 1000xg az 10 dakika süreyle santrifüj ° C sallanan bir kova rotor (Allegra 6KR santrifüj) Homojenat pelet hücresel enkaz ve çekirdekler aktarın. Bükülmüş Homojenat Resim Programı 1.
4. 4 5 dakika 32.500 xg'de Percoll-sukroz gradient, kap tüpleri, santrifüj başına süpernatant Layer 2 mL ° C (Beckman J2-21 santrifüj, JA-17 rotor) sabit açılı rotor (uygun adaptörler kullanarak Reaktifler ve Ekipmanları Masa bakınız. )
5. Pipet ve cam Pasteur pipeti kullanarak SN bant çözümü yukarıda atın. 15/23% arayüzü SN bant kapalı Pipet, buz üzerinde konik ve mağaza aktarın. Her degrade veya bir korteks 0,9-1,1 ml SN üretecektir.
6. 12 nM bir final konsantrasyon 1000x CaCl ₂ ve nonspesifik uyarma bastırmak için 1 mcM bir son konsantrasyonu 1 mM TTX stok eklemek SNS tuz konsantrasyonu, 10x stimülasyon tampon onda biri hacmi ekleyerek ayarlayın. (Downstream SN uygulamaları ile engel olacak CaCl ₂ ilavesi isteğe bağlıdır).
7. Micro BCA Protein Testi Kiti kullanarak SNS protein konsantrasyonu belirleyin. (Bradford protein testi Percoll çıkarımlar nedeniyle tavsiye edilmez.)
8. SNS protein transla doğrudan ve hızlı bir şekilde kullanılabilirTION çalışmalar. Diğer uygulamalar için SN lizat temizlenmeli veya Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanarak konsantre olabilir.

4. Temsilcisi sonuçları:

Fare korteks süreksiz Percoll-sakaroz gradyanlar (Şekil 1), 6 bant veya kesirler homojenize ve ayrıldı (Şekil 1) görüldü. Daha önce, yüksek molekül ağırlıklı gruplarından bileşenlerinin membran ve miyelin kırık ve pelet malzeme (Tablo 1) mitokondri veya organelleri yer alan olduğunu serebral ^korteks 3,5 sıçan gösterildi . % 23 /% 15 arayüzü (Band 5) zenginleştirilmiş SNS içeriyordu.

Sağlam SNS içeren% 23 /% 15 arayüzü, bant kaldırılır ve daha önce açıklandığı gibi, elektron mikroskobu (EM) tarafından ^{incelenmiştir.} 2,6 EM sağlam sinaptik veziküllerin varlığı ve presinaptik ve postsinaptik elemanlarının korunması (Şekil gösterdi 2). Pre-ve postsinaptik bölmeleri izolasyonu, sinyalizasyon ve her iki bölümlerinde meydana protein sentezi, incelenmesi için ^önemlidir. 7-13 Percoll sukroz gradient SN fraksiyonu küçük hücresel, nükleer ve organel kirlenme gördüm, böylece ham arıtma ama genel ayrılması iyi oldu.

Western Blot bakıldığında, Percoll kesirler SN bant (Şekil 3, Tablo 2) sinaptik saflık bir artış bekleniyor protein damgalı içeriyordu. Synaptic ve nöronal belirteçler zenginleştirilmiş SN bant (Band 5) muhafaza edildi ama diğer belirteçlerin bolluk önemli ölçüde azaldı. Özellikle, yapısal ve sinaptik belirteçler muhafaza veya gelişmiş iken GFAP, glial kökenli astrosit ve neoplastik hücreler için bir marker ve Lamin-B1, nükleer bir marker, varlığı, azdı. Buna ek olarak, protein sentezinde önemli bir rol oynayan mitokondri ve golgi gibi organelleri, belirteçleri saklama vardı.

BCA protein testi ile belirlenen SN grup için tipik verim mcL başına protein 250-500 ng. SNS 50 mcM glutamate/10 mcM glisin ile uyarılmış olduğu SNS faaliyet de novo protein sentezi miktarı tespit edildi [35S]-Met dahil edilmesi (Şekil 4) tarafından izlenir gibi mevcut. ² Bazal translasyonel aktivite 1.56 kat arttı (Glu) ya da aktif kat 5.12 Pin1 inhibitörü juglone'un. Pin1 inhibisyonu [35S]-Met eklenmesi de novo protein sentezinin artması nedeniyle olduğunu onaylamak için artan protein sentezini ² bilinir, biz 40 mcM anisomycin, protein sentezi inhibitörü eklenen ve belirgin bir azalma dahil gördüm bazal düzeylere göre Glu Mobile varlığı ve yokluğu. Ayrıca,% 2 SNS bütünlüğünü bozan Triton-X 100, ek üzerine, bazal çeviri% 75 oranında azalmıştır. ² Buna ek olarak, en sinaptik işaretleyici zenginleştirme gösterdi bantları (B4-B6) incelerken, SNS veya Band 5 de novo protein sentezi (Şekil 5) en büyük faaliyet vardı. Böylece, süreksiz Percoll sakaroz gradyanlar hızlı protein çeviri çalışma için kullanılabilecek bir aktif ve yüksek derecede zenginleştirilmiş SN bant üretir.

Çünkü sert koşulları tarafından mekanik hasarlara neden süreksiz Percoll sukroz gradient işlemi diğer yöntemlere göre daha avantajlıdır. Kortikal Homojenat temizlenir filtrasyon yöntemi ile karşılaştırıldığı zaman boyutunda azalma, ^3,14-15 Percoll yöntemi, daha fazla aktivite ile daha fazla SNS formları filtreleri bir dizi geçirilir. Şekil 6, 15/23% arayüzü çok daha az kırık membranların SNS ve büyük miktarda vardır Percoll sukroz gradient üzerinde filtrasyon yöntemi ile hazırlanan SNS bir kısım geçti görüldüğü gibi. De novo protein sentezi S35-met birleşme yoluyla ölçüldü, filtrasyon yöntemi ile hazırlanan SNS çok daha az aktif olan (Şekil 7). Translasyonel aktivite en üst düzeye çıkarmak için P14 ve P18 yaş arasında olan fareler kullanın. SN yetişkin farelerin hazırlanan, ancak juvenil fareler (Şekil 8) hazırlanan SN translasyonel aktivite önemli ölçüde artış görülmektedir olabilir.

Tablo 1. Homojenize fare korteksin süreksiz Percoll degrade since gruplarından bileşenleri ^3,5

Tablo 2. Süreksiz Percoll sukroz gradient bant bileşenlerinin Batı cıvata analizinin özeti her grubun kesirler Bağıl protein konsantrasyonları süreksiz Percol kullanarak izolel-sukroz gradient Western Blot tarafından belirlenir. Proteinini yok (-) 0 ≥ 0.2 (+), 0.2 ≥ 0.8 (++), veya> 0.8 (+++) kat daha fazla n süpernatant (S, santrifüj korteks Homojenat), temsilci protein mevcut = 3.

Programı 1: süreksiz Percoll sakaroz yoğunluk gradiyenti kullanarak SN hazırlanması şematik Fare beynin korteks disseke homojenize ve homojenize olmayan doku, hücre çekirdekleri ve membranlar gibi tüm organelleri kaldırmak için düşük hızda santrifüj edildi. Süreksiz degrade katmanları açıkça tanımlanmış olması gerekir. Inset resim sadece katmanları görselleştirmek için amaçlıdır mavi boyalı olan katmanları, bir örnek gösterir. Süpernatant süreksiz Percoll sakaroz degrade üst katmanlı ve orta hızda santrifüj edilir. SN grup, daha sonra degrade alınan ve kullanıma hazır.

Şekil 1. Süreksiz Percoll sakaroz degrade Homojenat fraksiyonasyon. Fare korteks homojenize ve 6 bantlar veya kesirler sebebiyet veren bir süreksiz Percoll-sukroz gradient ayrıldı. Saflaştırılmış, aktif SNS (*) Band 5 bulundu.

Şekil 2. SN hazırlıkları presinaptik ve postsinaptik unsurlarını muhafaza SNS heterojen bir karışım verir. SN hazırlık C57BL / 6 farelerinde (yaş P13 ile P21) hazırlanan bir elektron mikrografı korunmuş presinaptik ve postsinaptik elemanları ile daha önce açıklanan ve gösterir SNS olarak yapıldı. ^{2 6} Kırmızı oklar noktası post-sinaptik yoğunlukları. Ölçek çubuğu 1 mikron.

Şekil 3. SN hazırlıkları Western Blot analizleri sinaptik ve nöronal işaretleri saflaştırılmış SNS muhafaza olduğunu gösterdi (Band 5), ancak diğer belirteçlerin bolluğu önemli ölçüde azaldı. Süpernatant Immunoblots (S, kortikal Homojenat santrifüjle) ve bir süreksiz Gruplar 1-6 Percoll-sukroz gradient (postsinaptik yoğunluğu β-Aktin (yapısal, yükleme kontrolü), GFAP (astrositik), GP73 (Golgi), HSC70 (sitoplazmik ve nükleer), Lamin-B1 (nükleer), Prohibitin (mitokondrial) PSD95 için probed ), SNAP25 (sinaptik), sinaptofizin (sinaptik) ve β3-tubulin (nöron-spesifik). Bantları temsilcisi n = 3, Storm 860 Phosphorimager kullanılarak görüntülendi.

Şekil 4. SNS aktif ve [35S]-Met eklenmesi ile de novo protein sentezi gösterirler. SNS 37 ° C'de 10 dakika süreyle ön-dengelenmiş. Sonra SNS, 37, 40 mcM anisomycin veya 1 mcM juglone'un ile 15 dakika süreyle tedavi edilmezse veya ön tedavi ° C-Met, 20 ul Express Pro Etiket artı veya eksi Glu 37 S35 Kolay Etiket Mix [35S] ilave edilerek takip ° C 30 dk. Örnekleri, Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmış% 15 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak, kuru ve Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, n = 3 temsilcisi, ± SEM kullanarak quantitated edildi.

Şekil 5. Band süreksiz Percoll sukroz gradient 5 de novo protein sentezinin en yüksek seviyede yer alıyor . 4, 5 ve 6 Gruplar ve supernatant (S), kortikal Homojenat santrifüjle 37 ön-dengelenmiş ° C 10 dak. Sonra, [35S]-Met, Express Pro Etiket Mix S35 Kolay Etiket eklendi, artı ya da eksi 37 ° Glu ° C de 30 dakika oldu. Örnekleri, Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmış% 15 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak, kuru ve Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, n = 3 temsilcisi, ± SEM kullanarak quantitated edildi.

Şekil 6. Filtrasyon yöntemi hazırlanan SNS süreksiz Percoll sukroz gradient yöntemi hazırlanan SNS daha kırık membranlar ve daha az bütün SNS içerir . SNS, daha önce açıklandığı gibi gözenek boyutu azalan filtreler bir dizi homojenize korteks geçerek ^{hazırlanmıştır.} 3,14-15 filtrasyon yöntemi ile hazırlanan SNS bir kısım süreksiz Percoll sukroz gradient üzerinde santrifüj ve eşdeğer bir miktara göre süreksiz Percoll-sukroz gradient yöntemi kullanılarak malzeme.

Şekil 7. Filtrasyon yöntemi hazırlanan SNS SNS fro hazırlanan daha az de novo protein sentezi aktivitesi içerenm süreksiz Percoll sukroz gradient yöntemi. SNS azalan gözenek boyutu ile daha önce açıklandığı gibi filtreler, ^3,14-15 bir dizi ile homojenize korteks geçirerek ve süreksiz Percoll-sukroz gradient metodlar tarafından hazırlanmıştır. SNS hem hazırlıkları 37 ön-dengelenmiş ° C 10 dak. Sonra, [35S]-Met, Express Pro Etiket Mix S35 Kolay Etiket eklendi, artı ya da eksi 37 ° Glu ° C de 30 dakika oldu. Örnekleri, Pierce SDS-PAGE örnek Hazırlık Seti kullanılarak hazırlanmış% 15 poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak, kuru ve Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, n = 3 temsilcisi, ± SEM kullanarak quantitated edildi.

Şekil 8. Genç farelerde (P14) SNS yaşlı farelerin (P85) daha büyük translasyonel bir faaliyet var. SNS Glu Mobile ile 10 dakika süreyle 37 ° preequilibrated süreksiz Percoll-sukroz gradient yöntemi, ° C kullanarak farklı yaşlı farelerde hazırlanan tedavi veya tedavi edilmemiş edildi varlığı [35S]-Met, çıtçıt dondurulmuş, 30 dakika (Express Pro Etiket S35 Kolay Etiket Mix) ve daha sonra Pierce, SDS-PAGE Örnek Hazırlık Seti ile temizlenir. SNS, sonra% 12 SDS-poliakrilamid jel üzerinde çalıştırmak kurutulmuş ve n = 3, ± SEM Moleküler Dinamik Fırtına 860 phosphorimager, temsilci görüntülü edildi. P14 fareler SNS P85 farelerin en az 3 kat daha aktif.

Discussion

Burada açıklanan süreksiz Percoll sukroz gradient hazırlık sinaptik iletim deneyler çeşitli kullanılabilir aktif SNS, izole etmek için hızlı ve güvenilir bir yöntemdir. Dunkley ve ark. ^3,4 tarafından geliştirilen yöntem dayanmaktadır Bu gradyan yöntemi, birbiri ile ilişkili hem de pre-ve postsinaptik membran kaynaklı veziküller izole bir hücre içi beyin fraksiyonasyon işlemdir. Ileri arıtma olmadan bu SNS immunoprecipitation, batı blot, flow sitometri, [35S] üzerinden Met dahil, elektron mikroskobu ve enzim a...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifin Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Micro BCA Protein Testi Kiti	Delmek	23235
CaCl 2	Balıkçı	C79-500
CO 2 gaz	Airgas (UW-MDS)	CD 50
EDTA	RPI	E57020
EtOH	Balıkçı	A407SK-4
HCl	Balıkçı	A142-212
Percoll	GE Healthcare	17-0891-01
KH 2 PO 4	Balıkçı	P285-500
PierceSDS-PAGE Örnek Hazırlık Seti	Delmek	89888
NaCl	RPI	S23020
NaHCO 3	Balıkçı	BP328-500
Na 2 PHO 4	Balıkçı	S381-500
Sakaroz	RPI	S24060
Tris Base	RPI	T60040
Tetrodotoxin	Sigma	T5651
Express Pro Etiket Mix S35 Kolay Etiket	Perkin Elmer	NEG772
Ekipman	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Diseksiyon araçları
Dounce homojenizatör, 7 ml (iki cam ile birlikte "A" ve "B" etiketli havan)	Wheaton
P1000 Gilson Pipetman	Gilson	F123602
Allegra 6KR Santrifüj	Beckman Coulter	366830
GH 3.8 Rotor, Sallanır kova rotor	Beckman Coulter	360581
Beckman J2-21 Santrifüj	Beckman
Beckman tüpleri ile kapaklar	Beckman	355672
Beyaz duvarlı adaptörleri	Beckman	342327
Mavi duvarlı adaptörleri	Beckman
JA-17 Rotor, Sabit açılı rotor	Beckman	369691

Antikor Adı	Şirket	Katalog numarası	Ev Sahibi Türler	Seyreltme Faktörü
beta-aktin	Sigma	A5441	fare	1:2000
GFAP	Santa Cruz	sc-65.343	fare	1:200
GP73	Santa Cruz	SC-134.509	tavşan	1:200
HSC70	Santa Cruz	sc-7298	fare	1:200
Laminβ	Santa Cruz	SC-6261	keçi	1:200
Prohibitin	Santa Cruz	sc-28.259	tavşan	1:200
PSD95	Millipore	MAB1596	fare	5 mg / ml
SNAP25	AbCam	ab5666-100	tavşan	1:2000
Sinaptofizin	Millipore	MAB368	fare	1:500
β-3-tubulin	Santa Cruz	sc-80.016	fare	1:200