Method Article

Fare Uygulama M hücreleri tarafından Bakteriyel Alımı değerlendirin Peyer Patch Bağırsak Loop Testi bağlandı

DOI:

10.3791/3225

December 17th, 2011

In This Article

Summary

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M Peyer Kullanıcı yamaları içeren özel bir folikül ilişkili epitel hücreleri mukozal immunosurveillance bağırsak ile ilişkili lenfoid doku için önemli bir rol oynamaktadır. Burada bakteriyel transcytosis M hücreleri tarafından açıklanan değerlendirme yöntemi In vivo. Bu yöntem, bağışıklık sistemini M-hücre fonksiyonu anlamak için bir yöntem sağlar.

Abstract

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim bağırsak iç commensal bakterilerin büyük sayı ile yaşadığı. Gastrointestinal sistemin mukozal yüzeyinde, sürekli olarak onlara ve bazen patojenlere maruz kalmaktadır. Bağırsak ile ilişkili lenfoid doku (GALT), bu mikropların 1, 2 mukozal bağışıklık yanıtının indüksiyonu için önemli bir rol oynamaktadır . Mukozal immün yanıtı başlatmak için, mukozal antijenleri Peyer Kullanıcı yamaları gibi organize lenfoid folikül içine epitel bariyer boyunca bağırsak lümeni taşınması gerekir. Bu antijen transcytosis, uzmanlaşmış epitel M hücreleri 3, 4 aracılık eder . M hücreleri, makromoleküllerin ve mikropların aktif fagosite atipik epitel hücreleri vardır. Dendritik hücreler (DC) ve makrofajlar, bozulması için lizozomlar hedef antijenleri aksine, M hücreleri esas olarak içselleştirilmiş antijenleri transcytose. M hücreleri ile bu dinamik makromoleküler transcytosis altta yatan organize lenfoid folikül bir antijen sunard antijen-spesifik mukozal bağışıklık yanıtlarını başlatmak için gerekli olduğuna inanılmaktadır. Ancak, M hücreleri tarafından bu antijeni alımını teşvik eden moleküler mekanizmaları büyük ölçüde bilinmemektedir. Daha önce özellikle enterositler arasında M hücrelerinin apikal plazma membran glikoprotein ifade 2 (GP2), Escherichia coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium dahil olmak üzere, ortakçı ve enterobakteriler patojenik bir alt kümesi için bir transcytotic reseptörü olarak hizmet ettiği bildirdin ) FimH, bakteri dış zar 5 pili türü bir bileşeni tanıyarak. Burada, M hücreleri tarafından bakteriyel alımını değerlendirmek için bir fare Peyer yama bağırsak döngü testinin uygulanması için bir yöntem sunar. Bu yöntem, daha önceden açıklanan 6, 7 farenin bağırsak döngü testinin geliştirilmiş bir versiyonu. Geliştirilmiş noktalar şunlardır: 1. İsofluranın bir anestezik ajan olarak kullanılmıştır. 2. Bağlandı bağırsak döngü dahil olmak üzere yaklaşık 1 cming Peyer yama kurulmuştur. 3. M hücreleri tarafından alınan bakteriler, floresan, floresan etiketleme reaktif veya yeşil floresan proteininin (GFP) gibi eksprese floresan protein tarafından işaretlenmiştir. 4. M Peyer yama kapsayan folikül ilişkili epitel hücreleri, anti GP2 antikor ile tüm montaj immunostainig tarafından tespit edildi. 5. M hücreleri tarafından Floresan bakteriyel transcytosis konfokal mikroskobik analizi ile gözlenmiştir. Fare Peyer yama bağırsak döngü testinin cevap kaynağı olabilir ne tür ortakçı veya M hücreleri tarafından transcytosed patojen bakteriler, ve M hücreleri yoluyla mukozal bağışıklık sistemini uyarmak için nasıl moleküler mekanizmayı anlamak için bize yol açabilir.

Protocol

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Bakteri hücrelerinin hazırlanması

  1. Streak gliserol ve LB (GFP ifade S. Typhimurium) floresan bakteri süreyle 100 mcg / ml ampisilin içeren agar plaka.
  2. Kültür geceleme yeni LB orta 2 ml LB agar tek bir koloni.
  3. 1.0 600 nm dalga boyunda optik yoğunluk ulaşana kadar yeni LB orta ve inkübe 4.5 ml 0.5 ml bakteri kültürü ekleyin.
  4. Santrifüj yoluyla Hasat bakteri hücrelerinin (3.000 xg, 5 dk, 4 ° C).
  5. Süpernatantı atın ve 5.0 ml steril fosfat tamponu salin (PBS) ile iki kez yıkayın.
  6. 5 ml PBS ile bakteriyel pelletini tekrar ve inokulum olarak yaklaşık 10 7 koloni oluşturan birim (CFU) içeren süsp....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel süspansiyon ile bağlanan Peyer yama inkübasyon süresi genellikle M hücrelerine bakteriyel birleştirmek gözlemlemek için 1 saat. 4 saat inkübasyon durumda, bakterilerin genellikle Peyer Kullanıcı yamalar T hücre bölgesi tespit edilir. Buharlaşmış izofluran uçucu anestezi fareler istikrarlı tutmak gibi, bakteriyel süspansiyon ile bağlanan Peyer yama inkübasyon süresi Peyer yama T-hücre bölgeye hareket eden bakteriler gözlemlemek için uzatılabilir. Bu deneyde önemli bir nokta, bağırsak ligating, kan damarı.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgements

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu tekniği geliştirmek için tüm AYB üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma Öncelik Alanları Membran Trafik "(HO), ve" Bulaşıcı Olayları Matrix "(KH), Genç Bilim Adamları (SF ve KH), Bilimsel Araştırma (HO Bilimsel Araştırma için Grant-in-Aid tarafından kısmen desteklenmiştir. Yenilikçi Alanları Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Japonya "Hücre içi Lojistik" (HO),), Bilimsel Araştırma.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Reaktifi Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
LB Agar Ampisilin-
100
SIGMA L5667
Cy3 mono-Reaktif
Boya Paketi
GE Healthcare PA23001
Alexa Fluor 350
karboksilik asit,
succinimidyl ester
Invitrogen A10168
Inhalasyon anestezisi
cihaz
Shinano Seisakusho SN-487
Fiksasyon ve
Permeabilization
Çözüm
BD 554722
Anti-fare
Glikoprotein 2
antikor
MBL D278-3 200 kat dilüsyon (5μg/ml)
Keçi Anti-Rat IgG,
F (ab ') 2 parça
özel
Jackson
ImmunoResearch
112-505-006 200 kat dilüsyon (20μg/ml)
Alexa Fluor 633
Phalloidin
Moleküler Probları A22284 50 kat seyreltme
Konfokal lazer
mikroskop tarama
Leica Microsystems DMIRE2
DeltaVision
Restorasyon
deconvolution
mikroskop
Uygulamalı Hassas DeltaVision Çekirdek

References

Loading...
$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fagarasan, S., Honjo, T. Intestinal IgA synthesis: regulation of front-line body defences. Nat. Rev. Immunol. 3, 63-72 (2003).
  2. Hapfelmeier, S. Reversible microbial colonization of germ-free mice reveals the dynamics of IgA immune responses. Scienc....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

M CellsPeyer s PatchBacterial UptakeIntestinal Loop AssayConfocal MicroscopyGp2 AntibodyFluorescent BacteriaMucosal ImmunityStromal Vascular FractionCell Isolation

Related Articles