İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı İnsan Mikroglial Hücrelerinin Fare Beynine Transnazal Nakli

Özet

Kaynak: Parajuli, B., et.al. İmmünkompetan Farelerin Beyninde İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Mikroglia'nın Non-İnvaziv Transnazal Yol ile Transplantasyonu. J. Vis. Uzm. (2022).

Bu video, indüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikroglia (iPSMG) hücrelerinin bir fare beynine trans-nazal transplantasyonunu göstermektedir. Hyaluronidaz, geçirgenliği artırmak için mikroglial tükenmiş bir farenin burun deliklerine uygulanır. iPSMG süspansiyonu intranazal olarak uygulanır ve farenin iyileşmesine izin verilir. Beyin dokusunda iPSMG sağkalımını desteklemek için büyüme faktöründen zengin besiyerleri düzenli olarak uygulanır.

Protokol

Hayvan modellerini içeren tüm prosedürler, yerel kurumsal hayvan bakım komitesi ve JoVE veteriner inceleme kurulu tarafından gözden geçirilmiştir.

Hücre ortamı, transplantasyon ortamı ve anestezi karışımının hazırlanması

1. Dulbecco'nun modifiye Eagle besiyerine (DMEM) %10 fetal sığır serumu ve %0.1 penisilin / streptomisin ekleyerek hücre ortamını hazırlayın.
2. Hücre ortamına insan kolonisi uyarıcı faktör 1 veya hCSF1 (250 ng/mL) ve insan dönüştürücü büyüme faktörü beta 1 veya hTGF-β1 (100 ng/mL) ekleyerek transplantasyon ortamını hazırlayın.
3. 11.8 mL normal salin içinde 0.45 mL medetomidin hidroklorür, 1.2 mL midazolam ve 1.5 mL butorphanol tartarat karıştırarak intraperitoneal enjeksiyon için anestezi karışımını hazırlayın.

2. İndüklenmiş pluripotent kök hücre kaynaklı insan mikroglia (iPSMG) hücrelerinin hazırlanması

NOT: Dondurulmuş iPSMG (Malzeme Tablosu) kullanıma kadar -80 °C'de tutulmuştur.

1. Donmuş hücreleri 37 ° C'lik bir su banyosunda hızlı bir şekilde çözdürün. Görünür tüm buzlar eriyene kadar numuneleri döndürün.
2. Çözülmüş indüklenmiş pluripotent kök hücre türevli insan mikrogliasını (iPSMG) 37 ° C'ye ısıtılmış kültür ortamına ekleyin. 10 mL kültür ortamına ortam (1 × 10 6 hücre) içeren 1 mL çözülmüş hücre ekleyin.
3. Bir hücre peleti elde etmek için hücreleri 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
4. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini bozmadan tüm süpernatanı çıkarın. Transplantasyon ortamındaki sitokin konsantrasyonunun seyreltilmesini azaltmak için süpernatantın tamamen uzaklaştırılması arzu edilir.
5. 1 x 10⁵ hücre / μL'lik bir hücre konsantrasyonu elde etmek için transplantasyon ortamını ekleyin.
6. iPSMG'yi buzun üzerine yerleştirin ve hemen nakil işlemine devam edin.
   NOT: Transplantasyon için iPSMG'nin hazırlanması, kontaminasyonu önlemek için temiz bir tezgah üzerinde gerçekleştirilir.

3. Farenin transnazal transplantasyon (Tsn) için

1. hazırlanmasıYabani tip erkek fareleri (C57BL / 6J, 8 haftalık) 7 gün boyunca PLX5622 içeren bir diyetle besleyin.
2. 7^. günün sonunda PLX diyetini kesiniz ve çalışma sonuna kadar fareleri normal diyetle besleyin.
   NOT: PLX5622 içeren diyet, 1 kg AIN-93G'ye 1.2 g PLX5622 ilave edilerek hazırlanır (Materyal Tablosu).

4.

1. PLX beslemesinin kesilmesinden 24 saat sonra hücrelerin transnazal nakli, fareleri tartın ve anestezi karışımının intraperitoneal enjeksiyonu (0.2 mL / 20 g) kullanarak uyuşturun.
2. Fareler, pedal çekme refleksine (sert ayak parmağı tutam) yanıt vermeme ile değerlendirildiği gibi tamamen anestezi uygulandıktan sonra, fosfat tamponlu salin (PBS) (100 U / mL) içinde 2.5 μL hyaluronidaz uygulayın, iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan 1 saat önce her burun deliğine iki kez 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak burun mukozasının geçirgenliğini artırmak için.
3. Hyaluronidaz uygulamasından sonra, fareleri sırtüstü pozisyona getirin.
4. iPSMG'nin transnazal transplantasyonundan 10 dakika önce adım 4.2'yi tekrarlayın.
5. 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2,5 μL hücre süspansiyonu uygulayın.
6. Hücre süspansiyonunun diğer burun deliğine uygulanmasından önce fareyi 5 dakika boyunca sırtüstü pozisyonda tutun.
7. 4.5 ve 4.6 adımlarını dört kez tekrarlayın ve hayvan başına toplam 20 μL hacim uygulayın.
8. Anesteziden çıkana kadar fareyi 37 °C'lik bir ısı yastığı üzerinde sırtüstü pozisyonda yerleştirin.
9. PLX beslemesinin kesilmesinden 48 saat sonra, aynı farelerde 4.1-4.7 adımlarını bir kez daha tekrarlayın.
   NOT: Transplantasyon sırasında iPSMG hücrelerinin buz üzerine yerleştirildiğine dikkat edilmelidir.

5. Sitokinlerin uygulanması

:

1. Fareleri intraperitoneal anestezi karışımı enjeksiyonu (0.2 mL / 20 g) ile uyuşturun.
2. 10 μL'lik bir pipet ucu kullanarak farenin bir burun deliğine 2,5 μL transplantasyon ortamı uygulayın.
3. Transplantasyon ortamını diğer burun deliğine uygulamadan önce fareyi 5 dakika boyunca sırtüstü pozisyonda tutun.
4. Hayvan başına toplam 20 μL hacim uygulayarak 5.2 ve 5.3 adımlarını dört kez tekrarlayın.
   NOT: Çalışmanın sonuna kadar nakledilen iPSMG'nin canlılığı için her 12 saatte bir transplantasyon ortamının (insan sitokinleri) transnazal uygulamasının gerekli olduğuna dikkat edilmelidir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM)	Thermo Fisher Scientific	10566
AIN 93G	Oryantal Maya Co
Fetal sığır serumu	GE Healthcare Yaşam Bilimleri	SH30070.03
Dondurulmuş iPSMG	Shionogi & Co., Ltd		İlaç Keşfi ve Hastalık Araştırmaları Laboratuvarı
İnsan kolonisi uyarıcı faktör 1 (hCSF1)	PeproTech	300-25
Hyaluronidaz	Sigma-Aldrich	H-3506
Medetomidin hidroklorür	Meiji Seika	VETLI5
Midazolam	Astellas	18005A2
Paraformaldehit	Wako Saf Kimya Endüstrileri	162-16065
Penisilin / streptomisin	Thermo Fisher Scientific	15140-122
Pipet	Eppendorf	3120000011
Pipet ucu	Eppendorf	30076028
PLX5622	Amadis Chemical	A930097
Dönüştürücü büyüme faktörü-β1 (Tgf-b1)	PeproTech	100-21