Yöntem makalesi

Sonsuz Horizon Darbeli kullanarak tek taraflı Servikal Spinal Kord Yaralanması bir Contusive Modeli

DOI:

10.3791/3313

⸱

24 Temmuz 2012

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1International Collaboration on Repair Discoveries (ICORD), University of British Columbia , 2Department of Orthopaedics, University of British Columbia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sonsuz Horizon çarpma kullanarak servikal spinal kord yaralanması üretmek için güvenilir ve tekrarlanabilir bir şekilde anlatılmıştır. Yöntemi özel bir dizayn çerçeve yararlanır ve omurgayı stabilize etmek için kelepçe. Standart bir prosedür yeterli ve sürekli yaralanmalarda biyomekanik yaralanma parametreleri sonucu.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insan omurilik yaralanmalarının çoğunluğu servikal omurilikte meydana gelirken, laboratuvar araştırmalarının büyük çoğunluğu torasik spinal kord yaralı olduğu omurilik yaralanması (SKY) hayvan modellerinde çalışmaktadır. Çoğu insan kord hasarları omurilik şiddetle yerinden kemik veya yumuşak doku tarafından basıldı künt, non-penetran travma (örneğin motorlu taşıt kazası, spor yaralanmaları) sonucu meydana çünkü Ayrıca, SKY araştırmacıların çoğunluğunun görüşü vardır en önemli klinik yaralanma modelleri omurilik hızla contused kaldığı durumlar olduğunu. 1 Bu nedenle, insan çeviri yolda yeni tedavilerin klinik öncesi değerlendirilmesinde önemli bir adım içinde kontüzyon SKY modeli kendi etkinliğini bir değerlendirmesidir servikal spinal kord. Istihdam Burada, teknik özellikleri ve servikal SKY bir tek taraflı contusive modelinin çıkan anatomik ve davranışsal sonuçlar tanımladığınıSonsuz Horizon omurilik yaralanması çarpma.

Sprague Dawley sıçan C5 bir sol taraflı tek taraflı laminektomi yapıldı. Yaralanma modeli, biyomekanik, fonksiyonel ve histolojik sonuçların tekrarlanabilirliği optimize etmek için, biz 150 kdyn bir darbe gücü, 22.5 ° (hayvanlar 22.5 ° dönerek) bir etkisi yörüngesini kullanarak omurilik contused ve etkili konuma kapalı 1.4 mm orta hattın. Fonksiyonel iyileşme 6 haftaya kadar test ve modifiye Montoya Kullanıcı merdiven testi damat, silindir yetiştirme testi, yatay merdiveni testi ile değerlendirildi, bundan sonra omurilik beyaz ve gri cevherde tutucu için histolojik olarak değerlendirildi.

Burada sunulan yaralanması modelinde spinal kord, herhangi bir deneysel SKY modelinin önemli bir özelliği, tutarlı ve tekrarlanabilir biyomekanik güçler kazandırır. Spinal kord yanal yarısına kesikli histolojik hasara neden olur büyük ölçüde t yer aldığıYaralanma o ipsilateral tarafı. Yaralanma ve hayvanlar tarafından tolere, ancak önemli ve yaralanma sonrası hafta içinde sürekli olarak ön ayakları fonksiyonel açıklarının sonucu yok edilmektedir. Burada sunulan tek taraflı servikal yaralanması modelinde insan çeviri öncesinde potansiyel umut verici tedavilerin değerlendirmek isteyen araştırmacılar için bir kaynak olabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hayvan Holding için Çerçeve ve Kelepçe Tasarım: Set up

  1. Hayvan tutmak için çerçeve ve kelepçe Infinite Horizon (IH) Spinal Kord Yaralanması Darbeli karşılamak için özel olarak tasarlanmış oldu.
  2. Çerçevenin temel boyutları şunlardır (30.2 cm x 20.3 cm x 1.3 cm) IH cihazı (Şekil 1A) ile standart olarak gelir tablosu kılavuzu parantez içine sığdırmak için oyulmuş bir alüminyum platformdur.
  3. Dört Flexaframe ayak destek plakaları (ON Fisher Scientific, Toronto) platformu ve sekiz Flexaframe destek çubukları (ON Fisher Scientific, Toronto, 30.5 cm) sekiz Flexaframe destek bağlayıcılar (Şekil 1B) kullanılarak monte edilir tutturulur.
  4. Orta iki çubuk bağlanmış iki ek Flexaframe destek bağlantıları, ev yapılan özel kelepçe (Şekil 1B) için de geçerlidir.
  5. Hayvanın spinal kord dikey göre döndürülür hangi açısı keepin tarafından oluşturulurg yerine yatay çubuğun bir ve diğer yatay çubuğun (Şekil 2) arasında değişen yüksekliği.
  6. Kelepçe uzun 35.6 mm, yüksek 25.4 mm ve katı C4 ila C6 (Şekil 1C) için enine süreci altında tutun kapmak için tasarlanmış bir 7.6 mm çene ile. Kelepçe tasarımına ek ayrıntıları Choo ve arkadaşları tarafından daha önce tarif edilmiştir., 2009.

2. Cerrahi

  1. 300-350 gram ağırlığındaki erkek Sprague Dawley sıçanlar (Charles River Laboratories), oksijen (1 L / dak) (indüksiyon için% 4 ve bakım için% 2) izofluran ile anestezi uygulandı.
  2. Hayvanların anestezi altında düzlemi sonra, hayvanlar bir stereotaksik çerçeve (Kopf, Tujunga, CA) içinde yer alır.
  3. Lidokain cerrahi işlem 0.4 mL (20 mg / ml; Bimeda - MTC Hayvan Sağlığı A.Ş., Cambridge, Ontario, Kanada) esnasında kanama en aza indirmek için epinefrin ile dorsal yüzde cerrahi site çevresinde kas içine enjekte edilirl boyun bölgesinde.
  4. Bir 4-5 cm dorsal orta hat kesi kafatası tabanında başlayan ve kaudal uzanan, steril bir bisturi (# 15) kullanılarak yapılır.
  5. Steril Adson forseps açık açık omurga ve steril bir Alm retraktörü (Güzel Bilim Araçları, North Vancouver, BC) kas ayırın tutmak için eklenir ulaşmak için dorsal kas yoluyla incelemek için kullanılır.
  6. # 15 bistüri, kullanma C4-C7 lamina overlaying kaslarının orta hatta başlangıç ​​ve yanal onları süpürme, kapalı kazınır.
  7. Steril bir bisturi (# 15) ile birlikte bir kesi C6 C4 transvers süreçler altında kelepçe uyması için omurganın her iki tarafındaki enine süreçler bağlı kas yapılır.
  8. Steril ince Friedman-Pearson Rongeur (Güzel Bilim Araçları, North Vancouver, BC) uçlu ile sol C5 lamina dikkatle dura ve spinal kord görselleştirmek için kaldırılır.
  9. 1.5 mm'lik bir çapa sahip bir çubuk silah altında kaydırıldığındaböylece biraz omurga yükselterek ve kelepçe takma kolaylaştırılması, hayvan desteklemek için.
  10. C6 C4 lateral transvers süreçleri üzerine steril kelepçe çene takın ve vidalarını sıkın.
  11. Alm retraktör çıkarın.

3. Spinal Kord Yaralanması

  1. Kelepçe hayvan üzerine monte edildikten sonra, hayvanlar IH çarpma taşınır.
  2. Kelepçe yatay kapatma 22.5 ° lik bir açı (Şekil 2) de temin edilmiştir çerçevesinin üzerinde iki orta kolları metal tutucu içine sokulur.
  3. Hayvan düz durduğundan kadar stabil yükseklik ayarı (VWR, Mississauga, ON) sağlayan makas jack yukarıya kaldırılır.
  4. Kelepçe kelepçe üstüne küçük bir silindir seviyesi koyarak ve vidaları sıkarak yatay olduğundan emin olun. Tüm vidaları sıkı ve kurulum herhangi bir hareket olmadan sert olması önemlidir.
  5. Prosedürün geri kalan bir MICR altında gerçekleştirilmektediroscope (Leica MZ8).
  6. Indirin ve çarpma ucu merkezi C6 spinöz proses tepe üzerinde uçan kadar IH çarpma üzerine dikey ayar düğmesi ve iki yatay ayarlama düğmeleri kullanarak çarpma ucu (yuvarlatılmış kenarları ile çapı 15 mm) hedefliyoruz.
  7. Çarpma ucu merkezli sonra, y-ekseni ayar düğmesi tek ve C5 merkezine çarpma ucu hareket ettirmek için sol ve x ekseni yatay ayar düğmesi lateral ucu hareket ettirmek için iki beşinci tur (1.4 mm) açın.
  8. Bu çarpma ucu gri maddenin lateral yarısı hedefliyor doğrulamak için sadece dura yukarıda kadar ucu indirin.
  9. Iki dura yukarıda ucu 4 mm yükseltmek için döner dikey ayar düğmesini çevirin.
  10. Etki alanı bir pamuklu bir bez veya sopa ile kuru olduğundan emin olun.
  11. Program 150 kdyn istenen kuvvet ayarlayın ve çarpma tetiklemek için "Başlat Experiment" tıklayın.
  12. Yaralanma sonrası, yara laye kapatılmaktadır5-0 vicryl sütürlerle rs. Buprenorfin (0.03 mg / kg SC, Temgesic; Schering-Plough Corporation, Kenilworth, NJ) ve Salin (10 mL) önce subkutan ve cerrahi sonrası iki gün süreyle günde iki kez edilir. Hayvanlar yakından 2 hafta ve 6 hafta sonrası yaralanma için bir bir hafta boyunca günde iki kez izlenir.

4. Temsilcisi Sonuçlar

300-350 gr ağırlığında, Yirmi Dokuz erkek Sprague Dawley sıçan (Charles River Laboratuvarları) 150 kdyn bir kuvvet ayarında yaralandı. Çarpma ucu dikey 22.5 ° kapalı bir açıyla, orta hattın lateralinde 1.4 mm amaçlanmıştır. Ortalama gerçek gücü 155,55 oldu ± 0.73 kdyn. Ortalama yer değiştirme 1512,72 idi ± 27.86 um ve hızının 120,24 idi ± 0.52 mm / s (Şekil 3).

Davranış Sonuç Ölçütleri

Fonksiyonel kurtarma, test damat, yatay merdiveni testi, silindir yetiştirme testi kullanılarak değerlendirildiMontoya ve merdiven testi 1 değiştirilmiş. Hayvanlar sakatlanmadan önce eğitilmiş ve 2, 4 ve 6 hafta sonrası yaralanma değerlendirildi. Deney süresi boyunca sürdürülmesi önemli ön ayakları bozuklukları vardı.

Yatay Merdiven testi. Yaralanma önce, hayvanları sadece 4,75 yapılan ±% 0.73 hatalar ipsilateral ön ayakları üzerinde düzensiz aralıklı yatay merdiveni karşısında geçme ederken. Zedelenmesini takiben, ön uzuvların hayvanlar hata yüzdesini belirgin artış göstermiştir. Ipsilateral ön ayaklardan yüzde hataları 26.97 ± 2,92,% 26.23 ± 2.84 ve% 22,06 ± 2.05% 2, yaralanma sonrası 4 ve 6 hafta idi (Şekil 4A). Önemlisi, bu test ön ayaklardan düşüklüğü 6 hafta devam edildi.

Silindir Yetiştirme testi. Ipsilateral ön ayakları yüzdesi (sol + iki) arama sırasında kullanımı SKY sonrasında önemli ölçüde azalmıştır.Yaralanma öncesinde, hayvanlar ipsilateral ön ayaklardan 75.12 ±% 2.25 kullanılmıştır. Yaralanma sonrası hayvanların ipsilateral ön ayaklardan 8.59 ± 2 haftada% 1.80, 14.25 ± 2.65% 4 haftada ve 11.76 ± 6 hafta (Şekil 4B) az% 2,66 kullanılır.

Montoya Merdiven testi Modifiye. Ipsilateral ön ayakları ile alınan pelet sayısı yaralanma sonrası önemli oranda azalmıştır. Yaralanması önce, hayvanların 84,85 toplanan ± gıda sevabın 2,88%. Bununla birlikte, 2, 4 ve 6 hafta post-yaralanması az, hayvanların sadece 30,91 alınan ± 4.03,% 28,94 ± 4.38 ve% 25,86 ± peletleri (Şekil 4C) ve% 3.09.

Test Tımar. Yaralanma sonrası damat puanlarında dramatik düşüşler vardı. 2.00 ± 0.17, 4 hafta: 1.83 ± 0.17 ve 6. hafta: 1.79 ± 0.11 (figu SCI sonra ipsilateral damat puanları 2 hafta vardıyeniden 4D).

Histolojik Çıktıları

Beyaz madde ve Gri maddenin koruyucu. 150 kdyn bir kuvvet, 22.5 ° ve 1.4 mm lateral amacı açıda bir omurilik yaralanması bir örneği Şekil 5'te sunulmuştur. Yaralanma ipsilateral tarafta gri ve beyaz cevher büyük hasarlar görmesine neden olmuştur. Kortikospinal ve rubrospinal yolları Hem yaralandı ve 29 hayvanların dışında 23 ipsilateral tarafta bulunan parankim hasarı vardı. Beyaz ve gri cevher hasar boyuna ölçüde rostrally 2400 ve kaudal 2400 (Şekil 6) idi. Beyaz ve gri cevherde koruyucu "birikimli spread" (2000 mikron rostral ve merkez üssü için kaudal) bir brüt tahmini sağlamak için bölümler eklerken, ipsilateral tarafta sadece bağışladı beyaz cevherde% 51.8 ve gri maddenin% 39,7 oldu Kalan karşı taraf (Şekil 6) ile karşılaştırılmıştır.

figure-protocol-1
Şekil 1.. Sonsuz Horizon omurilik yaralanması çarpma. A. Genel Sonsuz Horizon çarpma ve kurmak. B. Çerçeve kurdu. Servikal transvers işlemleri tutmak için kelepçe C. Yakın plan görüntü. Kelepçenin: D. Özelliği (inç birimi). Önerilen tolerans <0.002 (Choo ve ark. 2009). büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-protocol-2
Şekil 2. A. İllüstrasyon ve ilgili çerçeve 0 ° (nötr) veya B 22.5 omurilik dönüşü elde etmek için ° 1.4 mm lateral amacı ile kurulmuştur.

figure-protocol-3
Şekil 3. Sonsuz Horizon çarpma Temsilcisi kuvvet ve yerdeğiştirme grafikleri. Ok içarpma ucu 20 kdyn ve deplasman kayıt başlatılır noktaya ulaştığı zaman ndicates. Gerçek gücü kuvveti vs zaman eğrisinin pik okunur ve karşılık gelen yerdeğiştirme hesaplanır. Aşağıdaki grafikler, tipik bir 150 kdyn kontüzyon tasvir, A. Deplasman vs zaman grafiği, B. Kuvvet vs Zaman grafiği. Bu grafikler elde gerçek kuvvet kordonu 1.287 mikron olarak ölçülmüştür içine 152 kdyn ve çarpma deplasman olduğunu göstermektedir. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

figure-protocol-4
Şekil 4. 150 kdyn gücü, 1.4 mm 22.5 ° ve amaç çarpma açılanma için davranış değerlendirmeleri orta hat. A. sol Yatay merdiven testi. B. Silindir yetiştirme testi. C. Modifiye Montoya merdiven testi. D. testi Tımar. Ipsilateral ön ayakları sonuçlandı önemli ve sustained bozukluklar kontralateral ön ayakları ile karşılaştırıldığında.

figure-protocol-5
Şekil 5. Kaudal 1600 um ile rostral 1600 um yaralı omurilik Temsilcisi görüntüler.

figure-protocol-6
6 Şekil. Histolojik değerlendirmeler. A. Yüzde beyaz ve gri cevherde bağışladı. 2000 civarında hasar lokasyonunun mikron büyük ölçüde korunmuştur Matter. Hasar minarenin 2000 mikron içinde bağışladı B. Toplu beyaz ve gri cevherde. Ipsilateral tarafı önemli ölçüde daha az karşı tarafa göre beyaz ve gri cevherde bağışladı etmişti. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda, 150 kdyn, dikey off 22.5 ° lik bir açı ve hattan 1.4 mm yanal amacı bir kuvvet Infinite Horizon (IH) çarpma kullanarak tek taraflı servikal kontüzyon modeli açıklamak. Bu ayarlar ile, bu önemli hasar rubrospinal, reticulospinal, vestibulospinal ve kortikospinal yolları beklenir bölgeler oluştu göründü büyük ölçüde ipsilateral tarafa içerdiği parankimal bozulma ile ipsilateral ön ayakları sürdürülen davranışsal açıkları üretebilmişlerdir çalıştırın. Bu modelin geliştirilmesi optimum yaralanma kuvveti, orta hat...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Çıkar çatışması ilan etti.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ekipman Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar
Sonsuz Horizon Darbeli Hassas Sistemleri ve Araçları IH-0400
Alüminyum sac Metalsupermarlets.com APT6061/500
Flexaframe ayak destek plakaları Fishers Bilimsel 1466625Q
Flexaframe mesnet çubuklarının Fishers Bilimsel 1466610GQ
Flexaframe Destek Konnektörler Fishers Bilimsel 1466620Q
1 Kelepçe Özel yapılmış Choo ve ark., 2009
Metal sahipleri Özel yapılmış Yukarıda bak
Darbeli ucu Özel yapılmış Çap: 1.15 mm
Stereotaktik çerçeve David Kopf Aletleri Model 900
Silindir Seviye Yijia ARAÇLAR YJ-SL0620
Mikroskop Leica Model #: MZ8
Laboratuvar makas jack VWR 12620-902

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, J. H., Tigchelaar, S., Liu, J., Stammers, A. M., Streijger, F., Tetzlaff, W., Kwon, B. K. Lack of neuroprotective effects of simvastatin and minocycline in a model of cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 225, 219-230 (2010).
  2. Kwon, B. K., Hillyer, J., Tetzlaff, W. Translational research in spinal cord injury: a survey of opinion from the SCI community. J. Neurotrauma. 27, 21-33 (2010).
  3. Gensel, J. C., Tovar, C. A., Hamers, F. P., Deibert, R. J., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Behavioral and histological characterization of unilateral cervical spinal cord contusion injury in rats. J. Neurotrauma. 23, 36-54 (2006).
  4. Kwon, B. K., Borisoff, J. F., Tetzlaff, W. Molecular targets for therapeutic intervention after spinal cord injury. Mol. Interv. 2, 244-258 (2002).
  5. Allen, A. R. Surgery of experimental lesions of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation. J. Am. Med. Assoc. 57, 878-880 (1911).
  6. Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Exp Neurol. 139, 244-256 (1996).
  7. Gruner, J. A. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat. J. Neurotrauma. 9, 123-128 (1992).
  8. Choo, A. M., Liu, J., Liu, Z., Dvorak, M., Tetzlaff, W., Oxland, T. R. Modeling spinal cord contusion, dislocation, and distraction: characterization of vertebral clamps, injury severities, and node of Ranvier deformations. J. Neurosci. Methods. 181, 6-17 (2009).
  9. Whishaw, I. Q., Piecharka, D. M., Drever, F. R. Complete and partial lesions of the pyramidal tract in the rat affect qualitative measures of skilled movements: impairment in fixations as a model for clumsy behavior. Neural. Plast. 10, 77-92 (2003).
  10. Jones, T. A., Schallert, T. Overgrowth and pruning of dendrites in adult rats recovering from neocortical damage. Brain Res. 581, 156-160 (1992).
  11. Liu, Y., Kim, D., Himes, B. T., Chow, S. Y., Schallert, T., Murray, M., Tessler, A., Fischer, I. Transplants of fibroblasts genetically modified to express BDNF promote regeneration of adult rat rubrospinal axons and recovery of forelimb function. J. Neurosci. 19, 4370-4387 (1999).
  12. Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
  13. Soblosky, J. S., Song, J. H., Dinh, D. H. Graded unilateral cervical spinal cord injury in the rat: evaluation of forelimb recovery and histological effects. Behav. Brain Res. 119, 1-13 (2001).
  14. McKenna, J. E., Prusky, G. T., Whishaw, I. Q. Cervical motoneuron topography reflects the proximodistal organization of muscles and movements of the rat forelimb: a retrograde carbocyanine dye analysis. J. Comp. Neurol. 419, 286-296 (2000).
  15. Sandrow, H. R., Shumsky, J. S., Amin, A., Houle, J. D. Aspiration of a cervical spinal contusion injury in preparation for delayed peripheral nerve grafting does not impair forelimb behavior or axon regeneration. Exp. Neurol. 210, 489-500 (2008).
  16. Popovich, P. G., Lemeshow, S., Gensel, J. C., Tovar, C. A. Independent evaluation of the effects of glibenclamide on reducing progressive hemorrhagic necrosis after cervical spinal cord injury. Exp. Neurol. 233, 615-622 (2012).
  17. Dunham, K. A., Siriphorn, A., Chompoopong, S., Floyd, C. L. Characterization of a graded cervical hemicontusion spinal cord injury model in adult male rats. J. Neurotrauma. 27, 2091-2106 (2010).
  18. Lee, J. H., Roy, J., Sohn, H. M., Cheong, M., Liu, J., Stammers, A. T., Tetzlaff, W., Kwon, B. K. Magnesium in a polyethylene glycol formulation provides neuroprotection after unilateral cervical spinal cord injury. Spine (Phila Pa 1976). 35, 2041-2048 (2010).
  19. Alstermark, B., Isa, T., Lundberg, A., Pettersson, L. G., Tantisira, B. The effect of low pyramidal lesions on forelimb movements in the cat. Neurosci. Res. 7, 71-75 (1989).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Tek Tarafl Kont zyon ModeliOmurilik Yaralanmas ModeliFonksiyonel yile me De erlendirmesiHistolojik Hasar AnaliziC5 Laminektomi Prosed rDarbe Kuvveti KalibrasyonuDavran sal Test BataryasBeyaz Madde Korunumu

İlgili makaleler