Yöntem makalesi
Canlı hücreler içinde ubiquitin-proteasome etkinliğini izlemek için bir yöntem tarif edilmektedir. A degron-İstikrarsızlaşmış GFP-(GFP-DGN) ve bir sabit GFP-dgnFS füzyon proteini oluşturulur ve bir lentiviral ifade vektörü kullanılarak hücre içine transdüksiyon ile uygulanır. Bu teknik, ubiquitin-proteasome etkinlik kolaylıkla Epifloresans ya da akış sitometrisi kullanılarak ölçülebilir hangi bir sabit GFP-dgn/GFP-dgnFS eksprese eden hücre soyu üretmek için olanak sağlar.
Proteazom anormal, katlanan hasar görmüş ya da oksitlenmiş proteinler 1, 2, proteolitik bozulması ile ilgili ana hücre içi organel olup. Proteazom faaliyet Bakım hücrenin stres yanıtı 3, hücre döngüsü kontrolü ve hücresel farklılaşma 4 veya bağışıklık sistemi yanıtı 5, gibi birçok temel hücresel süreçler karışmıştı. Ubiquitin-proteasome sistemi fonksiyon bozukluğu tümörler ve nörodejeneratif hastalıklar, 4, 6 ve gelişimi ile ilgili olmuştur. Buna ek olarak, proteazom aktivitesinde bir azalma hücresel yaşlanma ve organizma yaşlanma 7, 8, 9, 10 bir özellik olarak tespit edildi. Burada, bir GFP-DGN füzyon proteini kullanarak canlı hücrelerde ubikuitin-proteazom aktivitesini ölçmek için bir yöntem mevcut. Birincil hücreler canlı ubikuitin-proteazom etkinliğini izlemek edebilmek için, tamamlayıcı DNA (yeşil floresan protein (GFP)-DGN füzyon proteini kodlayan inşa GFP-DGN, kararsız) ve bir çerçeve kayması mutasyon (GFP-dgnFS, kararlı 11) taşıyan bir varyant lentiviral ekspresyon vektörleri içine yerleştirilir. Bu hücre tipi ya da donör yaşı bağımsız çok yüksek transfeksiyon verimliliği garanti çünkü geleneksel transfeksiyon teknikleri üzerinde bu tekniği tercih. GFP-dgnFS (kararlı) protein ve protazom inhibitörünün yokluğunda veya varlığında istikrarsız protein (GFP-DGN) tarafından gösterilen floresan arasındaki fark, her bir hücre soyu içinde ubiquitin-proteasome aktivitesi tahmin etmek için de kullanılabilir. Bu farklılıklar Epifloresans mikroskopi ile takip edilebilir ya da akış sitometrisi ile ölçülebilir.
1. Plazmid İnşaat
2. Virüs Üretimi
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Ubikuitin-proteazom aktivitesi için bir muhabir substrat olarak yeşil floresan protein (GFP) kullanarak ilk yayın 2000 12 yayımlanmıştır. O zamandan beri, GFP hücresel faaliyetler, özellikle ubikuitin-proteazom işlemini görselleştirmek için ortak bir araç haline gelmiştir. In vivo ubikuitin-proteazom etkinliğini izlemek için bir GFP tabanlı muhabiri ile bir transgenik fare modelinde 13 girmiştir. In vivo araştırmalar bu yayın ile ilgili ek 14 içinde kullanılan .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Çıkar çatışması ilan etti.
Bu çalışma tarafından finanse edildi: Avusturya Bilim Vakfı (FWF), Avrupa Komisyonu Entegre Projeler MiMAGE ve PROTEOMAGE, Hollanda Girişimi Genomics tarafından Yaşlanma (NFN S93) Ulusal Araştırma Ağı / Bilimsel Araştırma Hollanda Teşkilatı (NGI / NWO, 05.040.202 ve 050 - 060-810 NCHA), AB Mükemmellik Ömrü (FP6 036.894) Network finanse ve Genomik üzerinde Yenilik Odaklı Araştırma Programı (SenterNovem; IGE01014 ve IGE5007).
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | |
| pEGFP-C1 vektör | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pentr Yönlü TOPO Klonlama Kiti | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 Yönlü TOPO Klonlama Kiti | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofektamin 2000 Reaktif | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| PVDF filtre (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 | |
| Polietilen glikol | Sigma | P2139 | |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 | |
| Dulbecco Fosfat Sali Tamponlune 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromür | Sigma | 10,768-9 | |
| Blasticidin | Invitrogen | R21001 | |
| Kristal viyole | Sigma | C3886 | |
| FACS tüpler | BD Biosciences | ||
| Penisilin Streptomisin (Kalem-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutamin 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Sığır fetüs serumu (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Temel Olmayan Amino Asitler (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM 100 mM sodyum piruvat | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-glikoz (% 45) | Sigma | G8769 | |
| Genetisin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck | C5080 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Tripsin-EDTA (% 0.05) | Invitrogen | 25300054 |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste
İzin iste