Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi

21K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/3337

⸱

16 Kasım 2011

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Cell Biology and Centre for Biomedial Genetics, Leiden University Medical Centre

Bu makalede

Özet

Kantitatif büyüme faktörü (TGF)-β indüklenen 3 boyutlu kolajen jel işgali dönüştürme ölçmek için bir test tarif edilir. Bu testte, meme kanseri gelişiminin farklı aşamaları temsil hücre hatlarının MCF10A serisi, yararlanır. Bu yöntem, diğer hücre hatları ile birlikte kullanılmak üzere ve diğer potansiyel aktivatörleri veya işgali inhibitörleri araştırmak için kullanılmış olabilir kabul edilebilir.

Özet

TGF-β başlangıç ​​aşamasında bir tümör baskılayıcı gibi davranan, ancak daha sonraki bir aşamada 1,2 invazyon ve metastaz uyarıcı, meme kanseri ilerlemesinde rol karşı vardır . Ayrıca, TGF-β meme kanseri sık sık aşırı eksprese ve kendi ifadesini, kötü prognoz ve metastaz 3,4 ile ilişkilidir. TGF-β indükler işgali iyi anlaşılmış değildir hangi mekanizmaları.

TGF-β, TGF-β Tip II (TβRII) ve tip I (TβRI) reseptörleri aracılığıyla hücresel yanıtlar ortaya çıkarır. TGF-β indüklenen heteromeric kompleks oluşum üzerine, TβRII TβRI fosforile. Aktif TβRI reseptör Smads fosforilleyerek (R-Smads), yani Smad2 ve Smad3, onun hücre içi kanonik sinyal yolağı başlatır. Bu aktive R-Smads çekirdeğinde birikir ve hedef genlerin 5 transkripsiyonunu düzenleyen Smad4 heteromeric kompleksleri oluşturur. Buna ek olarak, daha önce described smad yolu olmayan bazı smad sinyalizasyon yolaklar aktivasyonu reseptör aktivasyonu sonuçları, örneğin Mitojen Protein Kinaz (MAPK) 6 yolakları.

Meme kanseri farklı aşamalarında TGF-β rolünü araştırmak için, biz MCF10A hücre sistemi kullanmak yaptı. Bu sistem kendiliğinden ölümsüzleştirdi MCF10A1 (M1), meme epitel hücreleri 7 oluşur, H-RAS farelerde 8 premalign lezyonları M1 türev MCF10AneoT (M2), ve gelen kurulmuştur M2 türev MCF10CA1a (M4) dönüştürdü M2 xenografts ve formlar 9 akciğer metastaz yeteneği ile yüksek dereceli karsinomlar. Bu MCF10A serisi hücre yanıtları farklı bir genetik arka önyargılı değildir malignite farklı sınıflarda eğitim imkanı sunuyor.

TGF-β indüklenen işgalinin analizi için, biz homotypic MCF10A sfero hücre kültürleri embe oluşturulan3D kollajen matriks in vitro (Şekil 1) dded. Bu modelleri yakından sfero 10 iç hatta dış nekrotik ve latent veya hücreleri üzerinde aktif ve invaziv hücrelerinde oksijen ve besin maddelerinin bir degrade kurarak in vivo insan tümörleri andırır. Sfero bazlı çalışmaları da tek tabaka kültürler 11 ilaç direnci daha iyi özetlemek için gösterilmiştir. Bu MCF10 3D model sistem malignite farklı aşamalarında meme hücrelerinin invaziv özelliklerini TGF-β sinyal etkisini araştırmak için izin verdi.

Protokol

1. Methocel çözüm Hazırlama (500 mL)

  1. Bir manyetik karıştırıcı içeren 500 ml şişe metilselüloz Otoklav 6 gr.
  2. 20 dakika, önceden ısıtılmış DMEM/F12 250 ml serum (60 ° C) olmadan metilselüloz çözülür.
  3. DMEM/F12 (RT),% 10 at serumu içeren 250 ml ekleyin. Mix gecede (4 ° C).
  4. Santrifüj (5000g, 2h, 4 ° C) çözüm temizleyin.
  5. Yeni bir tüp (stok solüsyonu yaklaşık% 90-95) açık oldukça viskoz bir çözüm atın.
  6. Mağaza, 4 ° C kullanana kadar.

2. Sfero kültür

  1. % 20 methocel solüsyonu (10 ml methocel ve 40 ml besi) hazırlayın.
  2. Hücreler PBS ile iki kez yıkayın, 37 yaşında% 0.1 tripsin ve inkübe hücreleri eklemek ° C
  3. Hücrelerin büyüme ortamında süspanse edin ve hücre sayımı.
  4. % 20, 10 000 ml başına hücrelerinin süspansiyon hazırlamak methocel.
  5. 96 iyi yuvarlak alt hücre süspansiyonuuspension levhalar (ortalama 100 ul).
  6. Ertesi gün, süspansiyon plakalar sfero oluşumunu kontrol edin. Tanecikler ise 1-3 gün sonra kullanıma hazır olacaktır.

3. Kollajen hazırlanması

  1. Buz üzerinde 8 ml kollajen, 1 ml PBS 10x, 1 ml 0.1 N NaOH ve 3 damla 0,1 N HCl çözeltisi hazırlayın. PH indikatörü şeritler çözümün bazı tespit ederek pH 7.4 olup olmadığını kontrol edin. PH aralığı olmadığını ayarlayın.
  2. 96 plaka kuyularda nötralize kollajen çözüm 50 ul ekle
  3. 37 inkübe ° C kollajen (90 dk) katılaşan kadar.
  4. Buz üzerinde methocel-kollajen-ligand çözümleri hazırlayın: kollajen çözüm her ligand pipet 1 parçası. Kollajen TGF-β 20 ng ml başına ekleyin. Farklı katmanlar üzerinde methocel ve difüzyon ile seyreltme sonra, TGF-β nihai konsantrasyonu 5 ng / ml Mix tarafından vorteks olacaktır. 1 methocel çözümün parçası ekleyin. Vorteks ile karıştırın.

4. Sfero embedding

  1. 200 ul pipet ucu kesilmiş yaklaşık 5 mm, 200 ul ucu yerleştirin. Pipet ile bir sfero emmek ve orta boş bir tabak içine dikkatlice dağıtmak. Sfero ucu içinde kalırsa izleyin. Sfero, beyaz bir nokta olarak görülebilir. Piston bırakmadan, 100 ul kollajen methocel karışımı emmek ve kollajen kaplı iyi 96 kollajen karışımı sfero dağıtmak. 12 parçacıklarının her bir durum için bunu yapın.
  2. Let en az 30 dakika katılaşmasını kollajen 37 ° C
  3. 200 ul ucu ile hava kabarcıklarını çıkarın.
  4. % 1.6 serum ve DMSO içinde çözülmüş inhibitörleri ile 50 ul orta ekleyin. SB-431.542 için 4 ul stok solüsyonu (10 mM) orta 1 ml ekleyin. Difüzyon sonra inhibitörü son konsantrasyonu 10 mcM olacaktır. TGF-β ve inhibitörleri, deney boyunca kalacaktır. 40X büyütme ile mikroskop altında parçacıklarının fotoğraflar çekin.
  5. 4 sonraTGF-β ve / veya inhibitörleri ile stimülasyon 8h, 40X büyütme ile mikroskop altında parçacıklarının fotoğraf çekmek.
  6. 2 gün sonra işgalci parçacıklarının alanı ölçün ve başlangıç ​​alanına çıkarmak. Ölçüm alanında bir sfero: Adobe Photoshop Extended (Şekil 2A) sfero resim ve Hızlı Seçim aracı (Şekil 2B) seçeneğini açın. Bir "artı" (+) işareti (şekil 2C) ile bir daire içine fare işaretçisi değişir. Sfero üzerine imleci sürüklerken, Photoshop, sfero sınırları tanıyacak. Sfero dışında bir alan seçili ise araç çubuğu (-) işareti, bu bölgede Alt tuşuna basarak veya tarafından belirtilen olumsuz bir seçim aracını kullanarak seçim dışında olabilir. (-) 'Eksi' ile bir daire içine imleç işareti ve yanlış seçilmiş bir alan üzerinde imleci sürükleyerek, bu alanda seçim (Şekil 2D) kaldırılır. Eğer gerekirse, birden fazla bölgede, Sh basarak seçilebilirift düğmesi. Daha doğru bir şekilde çalışmak için, fare işaretçisi boyutu araç çubuğunda fırça çapı (Şekil 2E) değiştirerek ayarlanabilir. Tüm sfero seçildiğinde, seçimin alan menü çubuğunda ANALİZ-TEDBİR aracılığıyla veya Ctrl + Shift + M (Şekil 2F) tuşuna basarak hesaplanır. Dosya adı ve piksel cinsinden seçim alanı yanı sıra diğer verileri (Şekil 2G) gösteren ölçüm kayıt penceresi görünecektir. Eğer birden çok seçim ölçülür, ilk satırı tüm alanları toplamını gösterir. Aşağıdaki satırlarda, bireysel seçimleri ölçümleri sunulmaktadır. Tüm ölçümlerin verileri bir metin dosyasına ihraç ve Excel'de açılabilir.

5. Temsilcisi sonuçları:

MCF10A1 (M1) normal meme epitel hücreleri ile sfero testinin bir örneği, H-RAS MCF10AneoT (M2) hücrelerin dönüştürdü ve M2-kökenli MCF10CA1a (M4) Şekil 3'te verilmiştir. M1 hücreleri olmadan sadece zayıf işgali gösterdistimülasyon, ancak önemli ölçüde işgal TGF-β tarafından uyarılması üzerine daha iyi. Buna karşılık, türev M1-M2 uyaranlara ek olmadan verimli bir şekilde zaten işgal RAS-dönüştürülmüş ve bu konuda daha fazla TGF-β tedavisi üzerine 4-5 kat arttı. M4 hücreleri hem de TGF-β ek olmadan, güçlü işgali gösterdi.

Sonra, biz kimyasal inhibitörleri kullanarak bu sfero model TGF-β-kaynaklı işgali etkileyebilecek olmadığını inceledi. Bu amaçla biz SB-431.542, bir ATP analog ve TβRI kinaz aktivitesini seçici inhibitörü gibi aktivin tip IB reseptör (ActRIB) ve aktivin kinaz-benzeri reseptör (ALK) 7 12 kullanılır. Beklendiği gibi, SB-431.542 kuvvetli M1 TGF-β indüklenen işgali, TGF-β indüklenen bu işgali belirten M2 ve M4 hücreleri (Şekil 4), inhibe TβRI-kinaz bağımlı. Buna ek olarak, bazal parçacıklarının işgali de güçlü bir şekilde inhibe, bu bazal işgali düşündüren de aynı zamandaTGF-β sarkık.

Şekil 1
Şekil 1: 3D sfero testinin akış çizelgesi. İlk olarak, hücreler, U-şekilli süspansiyonlar plakalar yapışmaz koşullar altında kaplanmıştır. Hücreler multcellular parçacıklarının aggregrate ve kollajen matriks içine gömülü olabilir. Bu kollajen matriks içine, onlar işgal mümkün.

Şekil 2
Şekil 2. Genişletilmiş Adobe Photoshop kullanarak parçacıklarının alan Kantitasyonu. (A) sfero resmi kullanarak wongly yer alan sfero (D) Kaldırma alanı seçmek için sfero üzerine imleci sürükleme Hızlı Seçim aracı Adobe Photoshop Extendend (B) Seçim (C) açıldı daha doğru bir alanı seçmek için Hızlı Seçim aracı fırça boyutunu olumsuz Hızlı Seçim aracı (E) Ayarı (F) Seçimiölçüm komutu bir ölçüm kayıt örneği kaydetmek için (G).

Şekil 3
Şekil 3 kendiliğinden ölümsüzleştirdi MCF10A1 (M1) (A) parçacıklarının TGF-β indüklenen işgali, MCF10AneoT (M2 (B) ve metastatik türevi MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 ve M4 parçacıklarının gömülü RAS dönüştürülmüş belirtildiği gibi 48 saat için kollajen içine TGF-β 5ng/ml ile tedavi edildi. AC Temsilcisi resim gömme gün alınmış ve iki gün sonra D Bağıl işgali gün 2 gün 0 eksi alan farkı gibi sayısal sonuçlar ifade edilmiştir. olarak ortalama ± SD 13 'den uyarlanmıştır.

Şekil 4a
Şekil 4b
Şekil 4. Bazal ve TGF-β-kaynaklı sfero işgali b inhibe ediliry SB-431.542. M1, M2 ve M4 parçacıklarının kollajen içine gömülü ve 5ng/ml TGF-β ve / veya 10 belirtildiği gibi mcM SB-431.542 ile tedavi edildi. Temsilcisi resimler 2 gün sonra alınan (A). Bağıl işgali gün 2 gün 0 (B) eksi alan farkı olarak belirlendi. Sonuçlar, ortalama ± SD 13 den uyarlanmıştır olarak ifade edilir .

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Biz MCF10A1 hücreleri ve malign türevleri TGF-β bağımlı bir şekilde bir kollajen matriks içine işgal sfero bir model oluşturdu. Birincisi, parçacıklarının metilselüloz varlığı 96-kuyular yuvarlak alt süspansiyon plakaları oluşur. Tabii ki, aynı zamanda U-şekilli poli-HEMA kaplı plakaları bu amaç için kullanılabilir. Hücreler metilselüloz yokluğunda ölecek beri Metilselüloz kesinlikle, bu adım gereklidir. Hücreler bu faktör kolajen orta op üst eklendiğinde TGF-β daha iyi cevap verdiğini bulundu beri TGF-β kollajen methoc...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması.

Teşekkürler

Biz hücre hatları için reaktifler ve Fred Miller (Barbara Ann Karmanos Kanser Intitute, Detroit, ABD) Ken Iwata (OSI Pharmaceuticals, New York, ABD) teşekkür ediyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifi Adı Şirket Katalog numarası Yorumlar (isteğe bağlı)
Metil selüloz Sigma-Aldrich M0512
PureCol Gelişmiş BioMatrix 5005-B
pH indikatörü şeritleri Merck 9533
96-iyi süspansiyon
plakalar 		Greiner Bio-one 650 (185)
TC yapışma 96-well
plakalar 		Greiner Bio-one 655 180

Kaynaklar

  1. Akhurst, R. J., Derynck, R. TGF-β signaling in cancer--a double-edged sword. Trends. Cell. Biol. 11, S44-S51 (2001).
  2. Massagué, J. TGF-β in Cancer. Cell. 134, 215-215 (2008).
  3. Ghellal, A. Prognostic significance of TGF-β1 and TGF-β in human breast carcinoma. Anticancer. Res. 20, 4413-4413 (2000).
  4. Sheen-Chen, S. M. Serum levels of transforming growth factor-β1 in patients with breast cancer. Arch. Surg. 136, 937-937 (2001).
  5. ten Dijke, P., Hill, C. S. New insights into TGF-β-Smad signaling. Trends Biochem. Sci. 29, 265-265 (2004).
  6. Moustakas, A., Heldin, C. H. Non-Smad TGF-β signals. J. Cell Sci. 118, 3573-3573 (2005).
  7. Soule, H. D. Isolation and characterization of a spontaneously immortalized human breast epithelial cell line, MCF-10. Cancer Res. 50, 6075-6075 (1990).
  8. Strickland, L. B. Progression of premalignant MCF10AT generates heterogeneous malignant variants with characteristic histologic types and immunohistochemical markers. Breast Cancer Res. Treat. 64, 235-235 (2000).
  9. Santner, S. J. Malignant MCF10CA1 cell lines derived from premalignant human breast epithelial MCF10AT cells. Breast Cancer Res. Treat. 65, 101-101 (2001).
  10. Smalley, K. S., Lioni, M., Herlyn, M. Life isn't flat: taking cancer biology to the next dimension. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 42, 242-242 (2006).
  11. Kobayashi, H. Acquired multicellular-mediated resistance to alkylating agents in cancer. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 3294-3294 (1993).
  12. Inman, G. J. SB-431542 is a potent and specific inhibitor of transforming growth factor-b superfamily type I activin receptor-like kinase (ALK) receptors ALK4, ALK5, and ALK7. Mol. Pharmacol. 62, 65-65 (2002).
  13. Wiercinska, E. The TGF-β/Smad pathway induces breast cancer cell invasion through the up-regulation of matrix metalloproteinase 2 and 9 in a spheroid invasion model system. Breast Cancer Res. Treat. 128, 657-657 (2011).
  14. Tang, B. TGF-β switches from tumor suppressor to prometastatic factor in a model of breast cancer progression. J. Clin. Invest. 112, 1116-1116 (2003).
  15. Provenzano, P. P. Collagen density promotes mammary tumor initiation and progression. BMC. Med. 6, 11-11 (2008).
  16. Ramaswamy, S. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-49 (2003).
  17. Debnath, J., Brugge, J. S. Modelling glandular epithelial cancers in three-dimensional cultures. Nat. Rev. Cancer. 5, 675-675 (2005).
  18. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 8, 839-839 (2007).
  19. Lee, G. Y. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nat. Methods. 4, 359-359 (2007).
  20. Petersen, O. W. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 9064-9064 (1992).
  21. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. 30, 256-256 (2011).
  22. Li, Q. p21-Activated kinase 1 coordinates aberrant cell survival and pericellular proteolysis in a three-dimensional culture model for premalignant progression of human breast cancer. 10, 314-314 (2011).
  23. Li, Q., Chow, A. B., Mattingly, R. R. Three-dimensional overlay culture models of human breast cancer reveal a critical sensitivity to mitogen-activated protein kinase kinase inhibitors. J. Pharmacol. Exp. Ther. 332, 821-821 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

TGF Beta nvazyonu3B Kolajen MatrisiMCF10A H creleriKolajen G mmenvaziv Alan KantifikasyonuMetilsel loz zeltisiTGF Beta nhibisyonuPhotoshop AnaliziMeme Kanseri Progresyonu
TGF-β-kaynaklı Invasion Tedbir Sfero Testi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.