Yöntem makalesi

Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi

DOI:

10.3791/3399

⸱

17 Kasım 2011

 ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , 2Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, hücrelerden serbest ve esterlenmiş biyoaktif yağ asitlerinin ekstraksiyonunu ve analizini gösterecektir. Yağ asitleri, kararlı izotop seyreltme, kiral sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik kimyasal iyonizasyon, çoklu reaksiyon izleme, kütle spektrometresi (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) kullanılarak doğru bir şekilde ölçülür.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Araşidonik asit (AA) ve linoleik asit (LA) gibi yağ asitlerinin metabolizması, çok sayıda stereoizomer1,2 dahil olmak üzere oksitlenmiş biyoaktif lipidlerin oluşumuyla sonuçlanır. Bu metabolitler serbest veya esterlenmiş yağ asitlerinden oluşturulabilir. Bu oksitlenmiş metabolitlerin çoğu biyolojik aktiviteye sahiptir ve kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar, astım ve kanser3-7 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda rol oynamaktadır. Oksitlenmiş biyoaktif lipitler enzimatik olarak veya reaktif oksijen türleri (ROS) tarafından oluşturulabilir. Yağ asitlerini metabolize eden enzimler arasında siklooksijenaz (COX), lipoksijenaz (LO) ve sitokromlar P450 (CYP'ler)1,8 bulunur. Enzimatik metabolizma enantiyoselektif oluşuma neden olurken, ROS oksidasyonu ürünlerin rasemik oluşumuna neden olur.

Bu protokol temel olarak AA- ve bazı LA türevli biyoaktif metabolitlerin analizine odaklanırken; diğer yağ asitlerinin metabolitlerine de kolayca uygulanabilir. Biyoaktif lipitler, sıvı-sıvı (l-l) ekstraksiyonu kullanılarak hücre lizatından veya ortamdan ekstrakte edilir. L-l ekstraksiyon işleminin başlangıcında, numune hazırlama sırasındaki hataları hesaba katmak için kararlı izotop iç standartları eklenir. Kararlı izotop seyreltmesi (SID), kütle spektrometresi (MS) analizi 9 sırasında metabolitlerin yaşayabileceği iyon baskılanması gibi farklılıkları da hesaba katar9. Ekstraksiyondan sonra, bir elektron yakalama (EC) reaktifi ile türevlendirmeden sonra, algılama hassasiyetini artırmak için pentaflorilbenzil bromür (PFB) kullanılır10,11. MS analizinin seçiciliğini artırmak için çoklu reaksiyon izleme (MRM) kullanılır. MS analizinden önce, lipitler kiral normal faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak ayrılır. HPLC koşulları, izlenen lipitlerin12 enantiyomerlerini ve çeşitli stereoizomerlerini ayırmak için optimize edilmiştir. Bu spesifik LC-MS yöntemi, prostaglandinleri (PG'ler), izoprostanları (isoP'ler), hidroksieikosatetraenoik asitleri (HETE'ler), hidroksioktadekadienoik asitleri (HODE'ler), oksoeikosatetraenoik asitleri (oksoETE'ler) ve oksooktadekadienoik asitleri (oksoODE'ler) izler; bununla birlikte, HPLC ve MS parametreleri herhangi bir yağ asidi metabolitini içerecek şekilde optimize edilebilir13.

Şu anda mevcut olan biyoanalitik yöntemlerin çoğu, enantiyomerlerin ayrı ayrı miktar tayinini hesaba katmamaktadır. Bu, metabolitlerin enzimatik olarak mı yoksa ROS tarafından mı oluşturulduğunu anlamaya çalışırken son derece önemlidir. Ek olarak, enantiyomerlerin oranları, belirli bir enzimatik oluşum yolu için kanıt sağlayabilir. SID kullanımı, metabolitlerin doğru bir şekilde ölçülmesine izin verir ve hazırlama sırasındaki herhangi bir numune kaybının yanı sıra iyonizasyon sırasında yaşanan farkları da hesaba katar. PFB elektron yakalama reaktifinin kullanılması, algılama hassasiyetini geleneksel APCI yöntemlerine göre iki kat artırır. Genel olarak, bu yöntem, SID-LC-EC-atmosferik basınçlı kimyasal iyonizasyon APCI-MRM/MS, biyoaktif lipitler için en hassas, seçici ve doğru miktar tayini yöntemlerinden biridir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Standart ve Dahili Standart Karışımlar

  1. Lipid ekstraksiyonundan önce, bir standart karışım (SM) ve bir dahili standart karışım (ISM) hazırlanmalıdır. SM için, aşağıdaki reaktif tablosunda listelenen her standarttan (toplam 25) 1 μg'lık eşdeğer hacmi, kalibre edilmiş bir şırınga kullanarak 10 mL'lik hacimsel bir şişeye ayırın. Standartları nitrojen altında kurutun ve 10 mL asetonitril (ACN) içinde sulandırın. Standart karışımın nihai konsantrasyonu 100 pg/μL olacaktır. 1 mL'lik alikotlara bölün ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C'de saklayın.
  2. Bu standart karışımdan, toplam 7 kalibrasyon standardı (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL ve 100 pg/ μL) için 6 standart seyreltme yapılabilir. Bu standartlar, kantitatif analizde kullanılan kalibrasyon eğrisini geliştirmek için hazırlanan her bir numune partisi ile birlikte çalıştırılacaktır.
  3. ISM için, aşağıdaki reaktif tablosunda listelenen her bir IS'den (toplam 14) 1 μg'lık eşdeğer hacmi, kalibre edilmiş bir şırınga kullanarak 10 mL'lik hacimsel bir şişeye alın ve nitrojen altında kurutun. ISM'yi 10 mL ACN'de yeniden oluşturun ve 1 mL alikotlara bölün. ISM'nin nihai konsantrasyonu 100 pg/μL olmalıdır. 1000 numuneyi işlemek için yeterli ISM vardır.
  4. SM ve ISM'yi -80°C'de saklayın.

2. Medya ve Hücre Lizatı Koleksiyonu

  1. Her 10 cm'lik yapışık hücre plakası için (~ 1 X 107), 10 mL'lik bir cam santrifüj tüpünde 3 mL ortam toplayın. Daha sonra, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 kez yıkayın. Plakaya 1 mL PBS ekleyin ve hücreleri plakadan kazıyın ve ikinci bir 10 mL cam santrifüj tüpüne pipetleyin. Bu noktada, prosedür şu anda devam etmeyecekse hücreler ve medya saklanabilir. Numuneleri uzun süreli saklama için -80°C'de veya bir haftadan daha kısa bir süre için -20°C'de saklayın.

3. Ortamdan Lipitlerin Ekstraksiyonu

  1. Serbest biyoaktif lipitler hücre ortamında bulunur ve bunlar tek aşamalı bir l-l ekstraksiyon prosedürü ile kolayca ekstrakte edilir. Toplanan ortama (2.1), 10 μL ISM ekleyin. Şu anda, 8 adet ek 10 mL cam santrifüj tüpü, kalibrasyon standartları için #0-7 olarak etiketlenmelidir. Bu tüplerin her birine 3 mL PBS ekleyin ve daha sonra 1-7 tüplerine (1.1'den 1-7) 10 μL uygun SM ekleyin.
  2. ISM'nin her kalibrasyon standardında dengelenmesine izin verin ve 10 dakika numune alın ve ardından 5 mL dietil eter ekleyin. Numuneler ve kalibrasyon standartları daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca düşük hızda çalkalayıcıya yerleştirilir.
  3. Çalkalandıktan sonra, tüm kalibrasyon standartları ve numuneler 1935 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjlenir. Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak üst fazı (organik) yeni bir 10 mL cam santrifüj tüpüne aktarın ve nitrojen altında kurutun.

4. Hücre Lizatından Lipitlerin Ekstraksiyonu

  1. Hücre örneklerini cam santrifüj tüplerinde 1935 X g'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı atın; her tüpe 2 mL PBS ekleyin ve kısaca girdaplayın. Protein miktar tayini için 25 μL numune alın. Hücre lizat normalizasyonu için toplam protein kullanılacaktır.
  2. Daha sonra, lizat / PBS karışımının yarısını ayrı bir 10 mL cam santrifüj tüpüne aktarın. Her örneğe 10 μL ISM ile birlikte 2 mL daha PBS ekleyin. 3.2 ve 3.3'teki ortamlar için açıklanan l-l ekstraksiyon işlemini izleyin. Bu alikot, hücrelerdeki serbest lipitleri ölçmek ve prostaglandinler gibi lipitlerin alkali bozunmasını önlemek için kullanılacaktır. Bu alikot, aşağıda açıklanan 4.3 ve 4.4 adımlarından geçmeyecektir.
  3. Esterleştirilmiş lipid ll ekstraksiyon işleminin ilk adımı, numunelerin her birine 5 mL CHCl3/MeOH (2:1) eklenmesini gerektirir. Numuneler, 30 dakika boyunca düşük hızda bir çalkalayıcıya ayarlanır. Çalkalandıktan sonra, numuneler 10 dakika boyunca 1935 x g'da santrifüjlenir. Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak, ll'lik ekstraksiyonun alt (organik) katmanını yeni bir 10 mL'lik cam santrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi nitrojen altında kurutun.

figure-protocol-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolde kullanılan standartlar ve dahili standartlar, hedeflenen bir lipidomik yöntemin temsilini sağlar. LC-MS analizi için bir Waters 2695 ayırma modülü ve Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra kullanıldı ve optimum parametre ayarları Tablo 1 ve 2'de bulunabilir. Ek olarak, bu ekstraksiyon protokolü yapışık hücreler için tasarlanmıştır, ancak diğer hücre tiplerinin yanı sıra idrar, kan ve doku dahil olmak üzere diğer biyolojik matrisler için değiştirilebilir. Birçok lipid standardı tic...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biyoaktif lipidlerin ölçümü için mevcut olan mevcut biyoanalitik yöntemlerin çoğu, kiral normal faz kromatografisi veya SID içermedikleri için o kadar kapsamlı değildir. Kiral normal faz LC, enantiyomerlerin ayrılması ve enzim veya ROS aracılı metabolizmayı ayırt edebilmek için kritik öneme sahiptir. SID kullanımı, ekstraksiyon veya analiz sırasında ortaya çıkan insan hatası veya komplikasyonların miktar tayini sırasında dikkate alınmasını sağlar. ECAPCI-MRM ile birlikte eklenen bu bileşenler, bunu biyoaktif lipitlerin analizi için mevcut olan en hassas, seçici yöntem haline getirir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
5-okso-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik-6,8,9,11,12,14,15-d7 asitCayman Chemical334250[2< sup>H < sub>7< / sub>] -5-ox & # 8211;TE Dahili Standart
5S-hidroksi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 asitCayman Chemical334230[2< / sup> H < sub> 8< / sub>] -5 ( S< / em >)-HETE İç Standart
12S-hidroksi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-eikosatetraenoik-5, 6,8,9,11,12,14,15-d8 asitCayman Chemical334570[2H8]-12(S)-HETE Dahili
Standart 15S-hidroksi-5Z,8Z,11Z,13E-eikosatetraenoik-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 asitCayman Chemical334720[2H8]-15(S)-HETE İç Standart
20-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik-16,16,17,18,18-d6 asitCayman Chemical390030[2< / sup>H < sub> 6 < / sub>] -20-HETE Dahili Standart
9S-hidroksi-10E, 12Z-oktadekadienoik-9,10,12,13-d4 asitCayman Chemical338410[2< / sup>H < sub>4< / sub>] -9 ( S< / em >)-HODE Dahili Standart
13S-hidroksi-9Z, 11E-oktadekadienoik-9,10,12,13-d4 asitCayman Chemical338610[2< / sup>H < sub>4< / sub>] -13 (S) -HODE Dahili Standart
9&alfa;,11&alfa;,15S-trihidroksi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 asitCayman Chemical316010[2H4]-PGF2α Dahili Standart
9 & alfa ;, 11 & alfa ;, 15S-trihidroksi- (8 & # 946;)-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 asitCayman Kimyasal316350[2H4< / sub>] -8-iso-PGF2a Dahili Standart< / sub>
9α, 11 & # 946;., 15S-trihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 asitCayman Kimyasal10008989[2< / sup>H4< / sub>] -11β-PGF2< / sub> Dahili Standart
9&alfa;,15S-dihidroksi-11-okso-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,19,19,20,20,20-d4 asitCayman Chemical312010[2< / sup>H < sub>4< / sub>] -PGD2< / sub> Dahili Standart
9-okso-11 & alfa ;, 15S-dihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 asitCayman Chemical314010[2< / sup>H4< / sub>]-PGE< alt>2 İç
Standart 5S, 12R-dihidroksi-6Z, 8E, 10E, 14Z-eikosatetraenoik-6,7,14,15-d4 asitCayman Kimyasal320110[2< / sup>H < sub>4< / sub>]-LTB4< / sub> Dahili Standart
9 & alfa; , 11,15S-trihidroksi-tromba-5Z, 13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 asitCayman Kimyasal319030[2H4]-TxB2 Dahili Standart
5-okso-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Chemical342505-oxo–TE Standardı
12-okso-5Z,8Z,10E,14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal3458012-öküz–TE Standardı
15-okso-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal3473015-ox & # 8211; TE Standardı
5R-hidroksi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal342255 ( R < / em >) -HETE Standardı
5S-hidroksi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal342305 ( S < / em >) -HETE Standardı
8R-hidroksi-5Z, 9E, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal343508 ( R < / em >) -HETE Standardı
8S-hidroksi-5Z, 9E, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal343608 ( S < / em >) -HETE Standardı
11R-hidroksi-5Z, 8Z, 12E, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal3450511 ( R< / em >) -HETE Standardı
11S-hidroksi-5Z, 8Z, 12E, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal3451011 ( S< / em >) -HETE Standardı
12R-hidroksi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal3456012 ( < / em >) -HETE Standardı
12S-hidroksi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal3457012 ( S < / em >) -HETE Standardı
15R-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal3471015 ( R < / em >) -HETE Standardı
15S-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal3472015 ( S < / em >) -HETE Standardı
20-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal9003020-HETE Standardı
9R-hidroksi-10E, 12Z-oktadekadienoik asitCayman Kimya384059 ( R < / em >) -HODE Standardı
9S-hidroksi-10E, 12Z-oktadekadienoik asitCayman Kimyasal384109 ( S < / em >) -HODE Standardı
13R-hidroksi-9Z, 11E-oktadekadienoik asitCayman Kimyasal3860513 ( R< / em>) -HODE Standardı
13S-hidroksi-9Z, 11E-oktadekadienoik asitCayman Kimyasal3861013 ( S< / em >) -HODE Standardı
9 & alfa ;, 11 & alfa ;, 15S-trihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asitCayman Chemical16010PGF < sub > 2 & alfa; < / alt> Standart
9 & alfa ;, 11 & alfa ;, 15S-trihidroksi- (8 & # 946;)-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asitCayman Kimyasal163508- iso< / em>-PGF2 ve alfa; Standart
9 & alfa ;, 11 & # 946;, 15S-trihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asitCayman Chemical1652011 & # 946 ; -PGF 2 < / sub> Standart
9 & alfa ;, 15S-dihidroksi-11-okso-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asitCayman Chemical12010PGD < sub > 2 < / sub> Standart
9-okso-11 & alfa ;, 15S-dihidroksi- (8 & # 946;)-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asitCayman Kimyasal143508-iso< / em>-PGE2< / alt> Standart
9-okso-11 ve alfa;, 15S-dihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asitCayman Kimyasal14010PGE2< / sub> Standart
5S, 12R-dihidroksi-6Z, 8E, 10E, 14Z-eikosatetraenoik asitCayman Kimyasal20110LTB4< / sub> Standart
9&alfa;,11,15S-trihidroksitromba-5Z,13E-dien-1-oik asitCayman Chemical19030TxB2 Standart
Fosfat Tamponlu TuzluGIBCO, Life Technologies tarafından14190
Dietil EterSigma-Aldrich346136
DiklorometanAcros Organics61030-1000susuz
N, N< / em>-diizopropiletil aminSigma-Aldrich387649
Pentaflorilbenzil bromürSigma-Aldrich101052
Hidroklorik AsitSigma-Aldrich320331
Potasyum HidroksitFluka00650
AsetonitrilFisher ScientificA996-4
MetanolFisher BilimselA454-4
KloroformFisher Bilimsel366927
HekzanFisher ScientificH303-4
İzopropanolFisher ScientificA464-4
EtanolDecon Laboratuvarları2716
WaterFisher ScientificW7-4
Pasteur PipetleriFisher Scientific13-678-200
10 mL Cam Santrifüj TüpleriKimble Chase73785-10Vidalı kapak
Fenolik Vidalı KapaklarKimble Chase73802-13415
Chiralcel ADH Kolon KiralTeknolojileri19325
HPLC şişeleriSular60000751CV
HPLC uçlarSularWAT094171

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
  2. Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).
  3. Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer. Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).
  4. Basu, S. Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology. Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).
  5. Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).
  6. Hersberger, M. Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins. Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).
  7. Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics. J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).
  8. Capdevila, J. H., Falck, J. R. Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).
  9. Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).
  10. Blair, I. A. Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators. Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).
  11. Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range. Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).
  12. Blair, I. A. Encyclopedia of Mass Spectrometry. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).
  13. Lee, S. H., Blair, I. A. Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS). Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Elektron Yakalama T revlendirmeKiral Normal Faz HPLCoklu Reaksiyon zlemeBiyoaktif Lipid EkstraksiyonuS v S v EkstraksiyonuAra idonik Asit MetabolitleriLinoleik Asit MetabolitleriEnantiyomer Ayr m

İlgili makaleler