Bu protokol, hücrelerden serbest ve esterlenmiş biyoaktif yağ asitlerinin ekstraksiyonunu ve analizini gösterecektir. Yağ asitleri, kararlı izotop seyreltme, kiral sıvı kromatografisi, elektron yakalama, atmosferik kimyasal iyonizasyon, çoklu reaksiyon izleme, kütle spektrometresi (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS) kullanılarak doğru bir şekilde ölçülür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hücresel Lipid Ekstraksiyon Hedefli Kararlı İzotop Seyreltme Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Analizi
Bu makalede
Özet
Özet
Araşidonik asit (AA) ve linoleik asit (LA) gibi yağ asitlerinin metabolizması, çok sayıda stereoizomer1,2 dahil olmak üzere oksitlenmiş biyoaktif lipidlerin oluşumuyla sonuçlanır. Bu metabolitler serbest veya esterlenmiş yağ asitlerinden oluşturulabilir. Bu oksitlenmiş metabolitlerin çoğu biyolojik aktiviteye sahiptir ve kardiyovasküler ve nörodejeneratif hastalıklar, astım ve kanser3-7 dahil olmak üzere çeşitli hastalıklarda rol oynamaktadır. Oksitlenmiş biyoaktif lipitler enzimatik olarak veya reaktif oksijen türleri (ROS) tarafından oluşturulabilir. Yağ asitlerini metabolize eden enzimler arasında siklooksijenaz (COX), lipoksijenaz (LO) ve sitokromlar P450 (CYP'ler)1,8 bulunur. Enzimatik metabolizma enantiyoselektif oluşuma neden olurken, ROS oksidasyonu ürünlerin rasemik oluşumuna neden olur.
Bu protokol temel olarak AA- ve bazı LA türevli biyoaktif metabolitlerin analizine odaklanırken; diğer yağ asitlerinin metabolitlerine de kolayca uygulanabilir. Biyoaktif lipitler, sıvı-sıvı (l-l) ekstraksiyonu kullanılarak hücre lizatından veya ortamdan ekstrakte edilir. L-l ekstraksiyon işleminin başlangıcında, numune hazırlama sırasındaki hataları hesaba katmak için kararlı izotop iç standartları eklenir. Kararlı izotop seyreltmesi (SID), kütle spektrometresi (MS) analizi 9 sırasında metabolitlerin yaşayabileceği iyon baskılanması gibi farklılıkları da hesaba katar9. Ekstraksiyondan sonra, bir elektron yakalama (EC) reaktifi ile türevlendirmeden sonra, algılama hassasiyetini artırmak için pentaflorilbenzil bromür (PFB) kullanılır10,11. MS analizinin seçiciliğini artırmak için çoklu reaksiyon izleme (MRM) kullanılır. MS analizinden önce, lipitler kiral normal faz yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) kullanılarak ayrılır. HPLC koşulları, izlenen lipitlerin12 enantiyomerlerini ve çeşitli stereoizomerlerini ayırmak için optimize edilmiştir. Bu spesifik LC-MS yöntemi, prostaglandinleri (PG'ler), izoprostanları (isoP'ler), hidroksieikosatetraenoik asitleri (HETE'ler), hidroksioktadekadienoik asitleri (HODE'ler), oksoeikosatetraenoik asitleri (oksoETE'ler) ve oksooktadekadienoik asitleri (oksoODE'ler) izler; bununla birlikte, HPLC ve MS parametreleri herhangi bir yağ asidi metabolitini içerecek şekilde optimize edilebilir13.
Şu anda mevcut olan biyoanalitik yöntemlerin çoğu, enantiyomerlerin ayrı ayrı miktar tayinini hesaba katmamaktadır. Bu, metabolitlerin enzimatik olarak mı yoksa ROS tarafından mı oluşturulduğunu anlamaya çalışırken son derece önemlidir. Ek olarak, enantiyomerlerin oranları, belirli bir enzimatik oluşum yolu için kanıt sağlayabilir. SID kullanımı, metabolitlerin doğru bir şekilde ölçülmesine izin verir ve hazırlama sırasındaki herhangi bir numune kaybının yanı sıra iyonizasyon sırasında yaşanan farkları da hesaba katar. PFB elektron yakalama reaktifinin kullanılması, algılama hassasiyetini geleneksel APCI yöntemlerine göre iki kat artırır. Genel olarak, bu yöntem, SID-LC-EC-atmosferik basınçlı kimyasal iyonizasyon APCI-MRM/MS, biyoaktif lipitler için en hassas, seçici ve doğru miktar tayini yöntemlerinden biridir.
Protokol
1. Standart ve Dahili Standart Karışımlar
- Lipid ekstraksiyonundan önce, bir standart karışım (SM) ve bir dahili standart karışım (ISM) hazırlanmalıdır. SM için, aşağıdaki reaktif tablosunda listelenen her standarttan (toplam 25) 1 μg'lık eşdeğer hacmi, kalibre edilmiş bir şırınga kullanarak 10 mL'lik hacimsel bir şişeye ayırın. Standartları nitrojen altında kurutun ve 10 mL asetonitril (ACN) içinde sulandırın. Standart karışımın nihai konsantrasyonu 100 pg/μL olacaktır. 1 mL'lik alikotlara bölün ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C'de saklayın.
- Bu standart karışımdan, toplam 7 kalibrasyon standardı (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL ve 100 pg/ μL) için 6 standart seyreltme yapılabilir. Bu standartlar, kantitatif analizde kullanılan kalibrasyon eğrisini geliştirmek için hazırlanan her bir numune partisi ile birlikte çalıştırılacaktır.
- ISM için, aşağıdaki reaktif tablosunda listelenen her bir IS'den (toplam 14) 1 μg'lık eşdeğer hacmi, kalibre edilmiş bir şırınga kullanarak 10 mL'lik hacimsel bir şişeye alın ve nitrojen altında kurutun. ISM'yi 10 mL ACN'de yeniden oluşturun ve 1 mL alikotlara bölün. ISM'nin nihai konsantrasyonu 100 pg/μL olmalıdır. 1000 numuneyi işlemek için yeterli ISM vardır.
- SM ve ISM'yi -80°C'de saklayın.
2. Medya ve Hücre Lizatı Koleksiyonu
- Her 10 cm'lik yapışık hücre plakası için (~ 1 X 107), 10 mL'lik bir cam santrifüj tüpünde 3 mL ortam toplayın. Daha sonra, hücreleri fosfat tamponlu salin (PBS) ile 2 kez yıkayın. Plakaya 1 mL PBS ekleyin ve hücreleri plakadan kazıyın ve ikinci bir 10 mL cam santrifüj tüpüne pipetleyin. Bu noktada, prosedür şu anda devam etmeyecekse hücreler ve medya saklanabilir. Numuneleri uzun süreli saklama için -80°C'de veya bir haftadan daha kısa bir süre için -20°C'de saklayın.
3. Ortamdan Lipitlerin Ekstraksiyonu
- Serbest biyoaktif lipitler hücre ortamında bulunur ve bunlar tek aşamalı bir l-l ekstraksiyon prosedürü ile kolayca ekstrakte edilir. Toplanan ortama (2.1), 10 μL ISM ekleyin. Şu anda, 8 adet ek 10 mL cam santrifüj tüpü, kalibrasyon standartları için #0-7 olarak etiketlenmelidir. Bu tüplerin her birine 3 mL PBS ekleyin ve daha sonra 1-7 tüplerine (1.1'den 1-7) 10 μL uygun SM ekleyin.
- ISM'nin her kalibrasyon standardında dengelenmesine izin verin ve 10 dakika numune alın ve ardından 5 mL dietil eter ekleyin. Numuneler ve kalibrasyon standartları daha sonra oda sıcaklığında 30 dakika boyunca düşük hızda çalkalayıcıya yerleştirilir.
- Çalkalandıktan sonra, tüm kalibrasyon standartları ve numuneler 1935 x g'da 10 dakika boyunca santrifüjlenir. Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak üst fazı (organik) yeni bir 10 mL cam santrifüj tüpüne aktarın ve nitrojen altında kurutun.
4. Hücre Lizatından Lipitlerin Ekstraksiyonu
- Hücre örneklerini cam santrifüj tüplerinde 1935 X g'de 5 dakika döndürün. Süpernatanı atın; her tüpe 2 mL PBS ekleyin ve kısaca girdaplayın. Protein miktar tayini için 25 μL numune alın. Hücre lizat normalizasyonu için toplam protein kullanılacaktır.
- Daha sonra, lizat / PBS karışımının yarısını ayrı bir 10 mL cam santrifüj tüpüne aktarın. Her örneğe 10 μL ISM ile birlikte 2 mL daha PBS ekleyin. 3.2 ve 3.3'teki ortamlar için açıklanan l-l ekstraksiyon işlemini izleyin. Bu alikot, hücrelerdeki serbest lipitleri ölçmek ve prostaglandinler gibi lipitlerin alkali bozunmasını önlemek için kullanılacaktır. Bu alikot, aşağıda açıklanan 4.3 ve 4.4 adımlarından geçmeyecektir.
- Esterleştirilmiş lipid ll ekstraksiyon işleminin ilk adımı, numunelerin her birine 5 mL CHCl3/MeOH (2:1) eklenmesini gerektirir. Numuneler, 30 dakika boyunca düşük hızda bir çalkalayıcıya ayarlanır. Çalkalandıktan sonra, numuneler 10 dakika boyunca 1935 x g'da santrifüjlenir. Daha sonra, bir Pasteur pipeti kullanarak, ll'lik ekstraksiyonun alt (organik) katmanını yeni bir 10 mL'lik cam santrifüj tüpüne aktarın ve numuneyi nitrojen altında kurutun.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokolde kullanılan standartlar ve dahili standartlar, hedeflenen bir lipidomik yöntemin temsilini sağlar. LC-MS analizi için bir Waters 2695 ayırma modülü ve Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra kullanıldı ve optimum parametre ayarları Tablo 1 ve 2'de bulunabilir. Ek olarak, bu ekstraksiyon protokolü yapışık hücreler için tasarlanmıştır, ancak diğer hücre tiplerinin yanı sıra idrar, kan ve doku dahil olmak üzere diğer biyolojik matrisler için değiştirilebilir. Birçok lipid standardı tic...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Herhangi bir çıkar çatışması beyan edilmemiştir.
Teşekkürler
Biyoaktif lipidlerin ölçümü için mevcut olan mevcut biyoanalitik yöntemlerin çoğu, kiral normal faz kromatografisi veya SID içermedikleri için o kadar kapsamlı değildir. Kiral normal faz LC, enantiyomerlerin ayrılması ve enzim veya ROS aracılı metabolizmayı ayırt edebilmek için kritik öneme sahiptir. SID kullanımı, ekstraksiyon veya analiz sırasında ortaya çıkan insan hatası veya komplikasyonların miktar tayini sırasında dikkate alınmasını sağlar. ECAPCI-MRM ile birlikte eklenen bu bileşenler, bunu biyoaktif lipitlerin analizi için mevcut olan en hassas, seçici yöntem haline getirir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 5-okso-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik-6,8,9,11,12,14,15-d7 asit | Cayman Chemical | 334250 | [2< sup>H < sub>7< / sub>] -5-ox & # 8211;TE Dahili Standart |
| 5S-hidroksi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 asit | Cayman Chemical | 334230 | [2< / sup> H < sub> 8< / sub>] -5 ( S< / em >)-HETE İç Standart |
| 12S-hidroksi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-eikosatetraenoik-5, 6,8,9,11,12,14,15-d8 asit | Cayman Chemical | 334570 | [2H8]-12(S)-HETE Dahili |
| Standart 15S-hidroksi-5Z,8Z,11Z,13E-eikosatetraenoik-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 asit | Cayman Chemical | 334720 | [2H8]-15(S)-HETE İç Standart |
| 20-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik-16,16,17,18,18-d6 asit | Cayman Chemical | 390030 | [2< / sup>H < sub> 6 < / sub>] -20-HETE Dahili Standart |
| 9S-hidroksi-10E, 12Z-oktadekadienoik-9,10,12,13-d4 asit | Cayman Chemical | 338410 | [2< / sup>H < sub>4< / sub>] -9 ( S< / em >)-HODE Dahili Standart |
| 13S-hidroksi-9Z, 11E-oktadekadienoik-9,10,12,13-d4 asit | Cayman Chemical | 338610 | [2< / sup>H < sub>4< / sub>] -13 (S) -HODE Dahili Standart |
| 9&alfa;,11&alfa;,15S-trihidroksi-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 asit | Cayman Chemical | 316010 | [2H4]-PGF2α Dahili Standart |
| 9 & alfa ;, 11 & alfa ;, 15S-trihidroksi- (8 & # 946;)-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 asit | Cayman Kimyasal | 316350 | [2H4< / sub>] -8-iso-PGF2a Dahili Standart< / sub> |
| 9α, 11 & # 946;., 15S-trihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 asit | Cayman Kimyasal | 10008989 | [2< / sup>H4< / sub>] -11β-PGF2< / sub> Dahili Standart |
| 9&alfa;,15S-dihidroksi-11-okso-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,19,19,20,20,20-d4 asit | Cayman Chemical | 312010 | [2< / sup>H < sub>4< / sub>] -PGD2< / sub> Dahili Standart |
| 9-okso-11 & alfa ;, 15S-dihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 asit | Cayman Chemical | 314010 | [2< / sup>H4< / sub>]-PGE< alt>2 İç |
| Standart 5S, 12R-dihidroksi-6Z, 8E, 10E, 14Z-eikosatetraenoik-6,7,14,15-d4 asit | Cayman Kimyasal | 320110 | [2< / sup>H < sub>4< / sub>]-LTB4< / sub> Dahili Standart |
| 9 & alfa; , 11,15S-trihidroksi-tromba-5Z, 13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 asit | Cayman Kimyasal | 319030 | [2H4]-TxB2 Dahili Standart |
| 5-okso-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Chemical | 34250 | 5-oxo–TE Standardı |
| 12-okso-5Z,8Z,10E,14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34580 | 12-öküz–TE Standardı |
| 15-okso-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34730 | 15-ox & # 8211; TE Standardı |
| 5R-hidroksi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34225 | 5 ( R < / em >) -HETE Standardı |
| 5S-hidroksi-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34230 | 5 ( S < / em >) -HETE Standardı |
| 8R-hidroksi-5Z, 9E, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34350 | 8 ( R < / em >) -HETE Standardı |
| 8S-hidroksi-5Z, 9E, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34360 | 8 ( S < / em >) -HETE Standardı |
| 11R-hidroksi-5Z, 8Z, 12E, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34505 | 11 ( R< / em >) -HETE Standardı |
| 11S-hidroksi-5Z, 8Z, 12E, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34510 | 11 ( S< / em >) -HETE Standardı |
| 12R-hidroksi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34560 | 12 ( < / em >) -HETE Standardı |
| 12S-hidroksi-5Z, 8Z, 10E, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34570 | 12 ( S < / em >) -HETE Standardı |
| 15R-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34710 | 15 ( R < / em >) -HETE Standardı |
| 15S-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 13E-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 34720 | 15 ( S < / em >) -HETE Standardı |
| 20-hidroksi-5Z, 8Z, 11Z, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 90030 | 20-HETE Standardı |
| 9R-hidroksi-10E, 12Z-oktadekadienoik asit | Cayman Kimya | 38405 | 9 ( R < / em >) -HODE Standardı |
| 9S-hidroksi-10E, 12Z-oktadekadienoik asit | Cayman Kimyasal | 38410 | 9 ( S < / em >) -HODE Standardı |
| 13R-hidroksi-9Z, 11E-oktadekadienoik asit | Cayman Kimyasal | 38605 | 13 ( R< / em>) -HODE Standardı |
| 13S-hidroksi-9Z, 11E-oktadekadienoik asit | Cayman Kimyasal | 38610 | 13 ( S< / em >) -HODE Standardı |
| 9 & alfa ;, 11 & alfa ;, 15S-trihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit | Cayman Chemical | 16010 | PGF < sub > 2 & alfa; < / alt> Standart |
| 9 & alfa ;, 11 & alfa ;, 15S-trihidroksi- (8 & # 946;)-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit | Cayman Kimyasal | 16350 | 8- iso< / em>-PGF2 ve alfa; Standart |
| 9 & alfa ;, 11 & # 946;, 15S-trihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit | Cayman Chemical | 16520 | 11 & # 946 ; -PGF 2 < / sub> Standart |
| 9 & alfa ;, 15S-dihidroksi-11-okso-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit | Cayman Chemical | 12010 | PGD < sub > 2 < / sub> Standart |
| 9-okso-11 & alfa ;, 15S-dihidroksi- (8 & # 946;)-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit | Cayman Kimyasal | 14350 | 8-iso< / em>-PGE2< / alt> Standart |
| 9-okso-11 ve alfa;, 15S-dihidroksi-prosta-5Z, 13E-dien-1-oik asit | Cayman Kimyasal | 14010 | PGE2< / sub> Standart |
| 5S, 12R-dihidroksi-6Z, 8E, 10E, 14Z-eikosatetraenoik asit | Cayman Kimyasal | 20110 | LTB4< / sub> Standart |
| 9&alfa;,11,15S-trihidroksitromba-5Z,13E-dien-1-oik asit | Cayman Chemical | 19030 | TxB2 Standart |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu | GIBCO, Life Technologies tarafından | 14190 | |
| Dietil Eter | Sigma-Aldrich | 346136 | |
| Diklorometan | Acros Organics | 61030-1000 | susuz |
| N, N< / em>-diizopropiletil amin | Sigma-Aldrich | 387649 | |
| Pentaflorilbenzil bromür | Sigma-Aldrich | 101052 | |
| Hidroklorik Asit | Sigma-Aldrich | 320331 | |
| Potasyum Hidroksit | Fluka | 00650 | |
| Asetonitril | Fisher Scientific | A996-4 | |
| Metanol | Fisher Bilimsel | A454-4 | |
| Kloroform | Fisher Bilimsel | 366927 | |
| Hekzan | Fisher Scientific | H303-4 | |
| İzopropanol | Fisher Scientific | A464-4 | |
| Etanol | Decon Laboratuvarları | 2716 | |
| Water | Fisher Scientific | W7-4 | |
| Pasteur Pipetleri | Fisher Scientific | 13-678-200 | |
| 10 mL Cam Santrifüj Tüpleri | Kimble Chase | 73785-10 | Vidalı kapak |
| Fenolik Vidalı Kapaklar | Kimble Chase | 73802-13415 | |
| Chiralcel ADH Kolon Kiral | Teknolojileri | 19325 | |
| HPLC şişeleri | Sular | 60000751CV | |
| HPLC uçlar | Sular | WAT094171 |
Kaynaklar
- Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
- Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).
- Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer. Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).
- Basu, S. Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology. Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).
- Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).
- Hersberger, M. Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins. Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).
- Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics. J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).
- Capdevila, J. H., Falck, J. R. Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).
- Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).
- Blair, I. A. Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators. Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).
- Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range. Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).
- Blair, I. A. Encyclopedia of Mass Spectrometry. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).
- Lee, S. H., Blair, I. A. Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS). Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
