Bizim protokolü bir ev geliştirme mağazasından satın dönüşüm Invitrogen Nupage Novex minigel kaset ve ucuz malzemeler ile aynı anda birden fazla protein jelleri dökün gösterilmiştir. Bu ekonomik ve akıcı yöntemi, birkaç hafta süreyle 4 ° C'de jeller depolamak için bir yöntem içerir. Piyasada satılan jeller, sık sık protein jeller çalıştırmak laboratuarlarından plastik jel kasetleri yeniden kullanarak önemli maliyet tasarrufu ve çevre yardımcı olabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ticari kasetleri yeniden kullanılmasıyla Dökme ve Protein Jel Koşu
Bu makalede
Özet
Özet
Sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SDS-PAGE) analizi ile proteinlerin değerlendirilmesi biyokimya ve moleküler biyoloji araştırmacılar 1-4 tarafından sıkça kullanılan bir tekniktir. Proteinlerin günlük analizleri gerçekleştirmek için laboratuar, ticari olarak mevcut poliakrilamid jel (~ $ 10/gel) maliyetini önemli bir zaman içinde olabilir. Bu maliyeti azaltmak için, bazı araştırmacılar kendi poliakrilamid jelleri hazırlamak. Bu jellerin dökme Geleneksel yöntemler genellikle özel ekipman ve pahalı olması ve birçok jeller dökme ve gelecekteki kullanım için saklama engel olabilir cam jel plakları kullanmaktadır. Ayrıca, döküm temizleme veya jel sırasında cam plakalar ele lisans laboratuvar derslerinde kendi kullanılmasına engel olabilir, bir güvenlik tehlikesi yaratmak, kazaen kırılması neden olabilir. Bizim protokolü geri dönüşüm Invitrogen Nupage Novex minigel kasetleri aynı anda birden fazla protein jelleri dökün, ve ucuz ma gösteren nasılterials bir ev geliştirme mağazasından satın. Bu ekonomik ve akıcı yöntemi, birkaç hafta süreyle 4 ° C'de jeller depolamak için bir yöntem içerir. Piyasada satılan jeller, sık sık protein jeller çalıştırmak laboratuarlarından plastik jel kasetleri yeniden kullanarak önemli maliyet tasarrufu ve çevre yardımcı olabilir. Ayrıca, plastik jel kasetleri lisans laboratuar sınıfları için ideal hale getiriyor kırılması, son derece dayanıklıdır.
Protokol
1. Kasetleri hazırlanıyor
- Temiz ön ve arka kullanılmış Invitrogen Nupage Novex minigel kaset, veya diğer ticari minigel kaset plakaları.
- Plastik epoksi yaklaşık 1-3 ml hazırlayın ve üreticinin talimatlarına göre iyice karıştırın.
- Kaset monte edildiğinde iki tabak temas edecek ön plaka, iç kenarına epoksi uygulayın.
- Açma kapama aşırı epoksi önlemek için kaset montaj sırasında arka yüzeyinin alt yarık aracılığıyla filtre kağıdı ya da bir karton parçası kaydırarak. Kısa sürede iki tabak monte gibi filtre kağıdı çıkarın.
- Sıkı bir mühür için kenarları boyunca bağlayıcı klipleri yerleştirin ve kasetleri tamamen tedavi etmek için epoksi gece bekletin.
- Elektrik bandı ile arka plaka altındaki yarık sürün.
2. Çözme jel Dökme
- 125 ml yan kol şişesi için aşağıdaki ekleyin:4X Tris-bazlı Ayrıştırıcı jel tampon pH 8.70,% 30.8 akrilamid / bisacrylamide 3.50 ml, Tip 3.25 ml, 2.25 ml 9 ml 'lik bir toplam hacim tepkin madde gradlı I için su (IRG-H2O).
- De-gaz vakum aparatı şişenin yan kol bağlama ve şişenin üstüne ters bir stoper yerleştirerek 10 dakika bir çözüm.
- Bir 50 ml tek kullanımlık polipropilen santrifüj tüpüne de-gassed çözeltisi 9 ml aktarılır ve 30% 10 ammounium persülfat (APS) ile ul ve N ul 6, N, N ', N',-tetramethylethylenediamine (TEMED) eklenir ve karıştırılır kabarcıkları tanıtma önlemek için çözüm dönen tarafından iyi.
- Hemen jel plakları arasında meydana gelen herhangi bir kabarcıklarını engellemek için kaset tarafı aşağı çalışmasına izin, kaset içine çözüm dökün. Ön (daha kısa) plakanın üst kenarından yaklaşık 2 cm ile kaset doldurun.
- Yavaşça 1X çözülmesi jel tamponu ile doyurulmuş 1-bütanol ve 0.5 ml ilave jel 1 için polimerize izinsaat.
3. Istifleme jel Dökme
- 4X Tris-bazlı bir istifleme jel tampon pH 6.80,% 30.8 akrilamid / bisacrylamide 0.40 ml, 3 ml 'lik bir toplam hacim için IRG-H2O 1.85 ml, 0.75 ml: bir 125 ml tarafında kolun şişesine aşağıdaki ekleyin.
- De-gazı olarak, adım 2'de açıklandığı 10 dakika süreyle çözeltisi.
- Istifleme jel solüsyonu gaz alma edilirken, çözülmesi jel üst 1X çözme jel tamponu ile doyurulmuş 1-bütanol dökünüz. IRG-2 H, O. ile bir kez çözülmesi jeli üstünde durulama Suyu dökün ve kalan sıvı emmek için bir ayyaş ya Whatman filtre kağıdı kullanın.
- Lütfen vakum gazından arındırılmış çözeltisinden 3 ml çıkarın ve% 10 APS ve TEMED 2 ul 9 ul ekleyin ve iyice karıştırın.
- Hızla kısa ön jel tabakası üst kenarına yakın olduğu kadar kaset tarafı aşağı çalışmasına izin, kaset çözüm dökün.
- , Jel kaset üst kısmına yerleştirilmiş bir temiz jel tarak eklemebunu tutturmak için tarak üzerinden kaset üzerinde bağlayıcı klip yerleştirin. Istifleme jel gece için 1 saat polimerize edelim.
4. Jel saklama
- Jel tamamen polimerize zaman, bağlayıcı klipleri çıkarın ve ısıl yapışmalı plastik poşet içinde kaset, ya da yeniden yapışmalı plastik torbaya yerleştirin.
- Kese içine% 0,1 sodyum azid içerir 1X istifleme jel tamponu 20 ml dökün.
- 5 saniye çantası mühür ve çanta hiçbir sızıntı olmadığından emin olmak ısıtın.
- 4 ° C'de jel depolamak
5. Numunelerin Hazırlanması
- Ince duvarlı mikrosantrifüj tüpü, protein numune 6.5 ul, bir 2x Novex Tris-Glisin SDS numune tamponu, 100 mM ditiyotretol (DTT) ve IRG-H 2 O 1 ul (gerekirse) 7.5 ul ekleyebilirsiniz 15 ul toplam hacim.
- Vorteks ile örnek karıştırmak ve kısa bir süre için borunun alt tarafına içeriği getirmek için örnek santrifüjlenir.
- denatüre 70 ° C Örnek 10 dakika için.
6. Jeli çalıştıran
- Novex jel alet ayarlayın.
- Iç haznesine Nupage antioksidan 500 ul, ve Tris-Glisin dış tamponu çalıştırma odasına 300 ml içeren Tris-Glisin tampon Çalıştırma 200 ml ilave edilir.
- Bir jel yükleme pipet kullanarak kuyulara denatüre protein örneklerinin (15 ul) yükleyin.
- 60-70 dakika 200 V jel çalıştırın.
7. Jel boyama
- Jel cihazdan Kaseti çıkarın ve jel bıçak ya da sert bir spatula kullanarak arayla iki plastik jel plakları meraklı epoksi mühür kırmak. Jel yırtmayın özen, plakalardan jeli dikkatle ayırın.
- IRG-H ile jel nazik ajitasyon ile 2 O üç kere durulanır.
- Nazik ajitasyon ile 1 saat boyunca Invitrogen SimplyBlue SafeStain ile jel leke.
- Boyama çözümü kapalı dökün veIRG-2 H, O. ile jel destain
8. Kasetleri Temizleme
- Tekrar tekrar böylece kasetleri tüm epoksi kazıyarak ya da soyma metal bir spatula kullanın.
- Bir deterjan solüsyonu ile plastik jel plakları her yıkayın ve distile su takip musluk suyu ile iyice durulayın.
9. Temsilcisi Sonuçlar
Epoksi bir su geçirmez sızdırmazlık, (Şekil 1) oluşturacak, çünkü, kaset akrilamid çözeltisi içine döküldü ve bunların olduğunda sızıntı olmayacaktır. Buna ek olarak, jel kasetleri kolayca boyanması için jel almak için açılabilir ve epoksi onların devam yeniden kullanılmasına izin vermek kasetlerinin sıyrılır edilebilir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, jel protein belirteçler ve rutin protein elektroforez için uygun örnek gruplarından net ayrım gösterir.
Şekil 1.. Staminigel kasetleri mühürlemek için epoksi katyondur. epoksi ince bir tabaka montajı için önceden kasetleri birinin ucuna uygulanır. Epoksi vurgulamak için, bu görüntü yanlış renkli kırmızı oldu.
Şekil 2. Bir SDS-Tris-glisin jel üzerinde, proteinlerin ayrılması tekrar kullanılabilir minigel kasetleri kullanılarak döküldü. Yukarıda tarif edildiği gibi SDS-PAGE uygulanmıştır. Aşağıdaki elektroforez jel üreticinin talimatlarına göre SimplyBlue SafeStain ile boyanmış minigel kaset, kaldırılır ve aktarılan beyaz ışık kullanılarak fotoğraflandı. Lane M SeeBlue Plus2 öncesi lekeli protein standartları içerir. Şeritli M proteinlerin moleküler ağırlıkları kilodalton (kDa) içinde jel sağ tarafında gösterildiği edilir. Diğer bir şerit glutation-S-transferaz (GST)-etiketli proteini ifade eden bakteriler bir temizlenir lizat proteinleri göstermektedir. Gösterildiği proteinleri g yıkanmış olanlardırGST-etiketli protein elüsyon önce lutathione boncuk.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Protein jel elektroforez en moleküler biyoloji laboratuvarları için vazgeçilmez bir yöntemdir. Piyasada bulunan minigels rahatlık yüksek düzeyde sağlamak, ama pahalıya mal olabilir. Burada ticari minigels popüler bir marka minigel kasetleri yeniden nasıl kullanılacağını göstermektedir. Bu yöntem jellerin hazır bir kaynağı sahip kolaylık korur, ancak ticari minigels maliyetinin bir kısmını. Bu prosedür önemli adımlarından tamamen sızmasını önlemek için unpolymerized akrilamid eklemeden önce kasetleri mühürlemek için epok...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Yazarlar AH Yaşam ödülü için UF Bilim Howard Hughes Tıp Enstitüsü teşekkür
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifi Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Invitrogen Nupage Novex Minigel Kaset (1.0 mm) | Invitrogen | NC2010 | 2, 5, 10, 12, 15 ve 2B kuyu mevcuttur |
| Plastik Epoksi | Loctite'a | 108771 | |
| Elektrik Teyp | İskoç | ||
| 125 mL yan kol şişesi | Borcam | 5360 | |
| 4X Tris-Base çözme jel tamponu | 1.5 M Tris-bazlı pH 8.7 | ||
| akrilamid | Fisher Scientific | 01065-500 | |
| Bis-akrilamit | MP Biomedicals, Inc | 800173 | |
| % 30.8 'akrilamid çözüm | 30:0.8 akrilamid: bis-akrilamid IRG-2 H O | ||
| % 10 APS | Fisher Scientific | BP179-25 | 1 ml IRG-H 2 O da 0.1 g amonyum persülfat, kullanımdan hemen önce hazırlanan |
| TEMED | Arcos Organics | 138450500 | |
| 1-bütanol 1X Ayrıştırıcı jel tamponu ile doyurulmuş | 1X çözme jel tampon 05:02 1-bütanol | ||
| 4X Tris-Base istifleme jel tamponu | 1.5 M Tris-bazlı pH 6.8 | ||
| Jel tarak | Invitrogen | NC3015 | 15 iyi, 1.0 mm kalınlık |
| Darbe Sealer | TEW Elektrikli Isıtma Ekipmanları | ||
| Isı Mühürlenebilir Kılıfı | Kapak / Scotchpak | 1 pint boyutu (6.5 "x 8") | |
| Jel depolama tamponu | 1X% 0,1 sodyum azid ile jel tamponu istifleme | ||
| Novex SDS Tris-Glisin numune tamponu (2X) | Invitrogen | LC2676 | |
| DTT | FisherBiotech | BP172-5 | |
| 10X Tris-Gylcine Running tampon | Invitrogen | LC2675 | 10X stok 1L: 29.0 g Tris-Base, 144.0 g Glisin, 10,0 g SDS |
| XCell SureLock Mini-Hücre | Invitrogen | EI0001 | |
| Jel Bıçak | Invitrogen | EI9010 | |
| SimplyBlue Güvenli Leke | Invitrogen | LC6065 |
Kaynaklar
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Raymond, S., Weintraub, L. Acrylamide gel as a supporting medium for zone electrophoresis. Science. 130, 711-711 (1959).
- Schägger, H., von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal. Biochem. 166, 368-379 (1987).
- Shapiro, A. L., Viñuela, E., Maizel, J. V. Molecular weight estimation of polypeptide chains by electrophoresis in SDS-polyacrylamide gels. Biochem. Biophys. Res. Commun. 28, 815-820 (1967).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
