Endojen NADH Floresans iki-foton Imaging tarafından Fare Serebral Korteks olarak Microregional Hipoksi Algılama

Özet

Burada doğrudan fare kortekste microregional doku hipoksisi görselleştirmek için bir yöntem tarif In vivo. Bu nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) ve kortikal mikrodolaşım eşzamanlı iki-fotonlu görüntüleme dayanmaktadır. Bu yöntem, doku oksijen kaynağının, yüksek çözünürlükte analizi için yararlıdır.

Özet

Metabolik talebin yüksek düzeyde çalışabilmesi için beyin yeteneği kan akımı ve doku oksijen difüzyon yoluyla sürekli oksijen kaynağı bağlıdır. Burada doğrudan microregional doku hipoksisi görselleştirmek için ve fare kortekste perivasküler oksijen gradyanlar anlaması için bir görüntülenmiştir deneysel ve metodolojik protokolü sunarız. Bu nikotinamid adenin dinükleotid (NADH) endojen floresans yoğunluğu ve doku NADH floresans aniden 10 mmHg ^1'in altına doku oksijen düzeyleri artar gözlenen doku, oksijen kısmi basıncı arasındaki doğrusal olmayan ilişki dayanmaktadır. Biz Texas-Kırmızı dekstran ile kıyasladı içsel NADH doku floresans ve plazma eşzamanlı uyarım sağlayan 740 nm'de iki foton uyarması kullanın. Mevcut yaklaşımlar üzerindeki bu yöntemin avantajlarını aşağıdakileri içerir: bir iç doku sinyali yararlanır ve in vivo im standart iki-fotonlu kullanılarak yapılabilirekipmanı yaşlanma; bu ~ 50 um arasındaki bir derinliğe sahip çözünürlüğü görüş tüm alan sürekli izleme izin verir. Biz serebral kan damarlarından uzak beyin dokusu alanları vasküler oksijen kaynağı yaşanan düşüşün ardından işlevsel hipoksik olmak için ilk olarak hassas sınır alanlarda karşılık göstermektedir. Bu yöntem, görüntü microregional kortikal oksijen bir sağlar ve dolayısıyla nörovasküler hastalıklar ve inme yetersiz veya kısıtlı doku oksijen kaynağının bir rol incelenmesi için yararlıdır.

Protokol

1. Görüntüleme için hayvan hazırlanması

Not: Biz yetişkin C57BL fare kullanın. Farklı transgenik suşları araştırma sorusu bağlı olarak kullanılabilir. Mikrovasküler cerrahi ve pulse oksimetre beyaz kürk fareler (örneğin FVB suşu) de kolaylaşır.

1. Tezgahında cerrahi sitesi hazırlayın. Tüm cerrahi aletler% 70 etanol ile otoklav veya dezenfekte edilmesi gerekir.
2. Bir rektal prob takın ve sürekli işlem boyunca hayvanın vücut ısısını ölçmek
3. Başlangıçta% 5 izofluran kullanılarak, fare uyuşturmak. 15-30 s, hayvan hareket değilken, bir ısıtma yastığı (37 ° C) üzerine yerleştirin ve izofluran% 1.3-1.5) içeren havanın sürekli teslim için bir yüz maskesi uygulayın. Hayvan bir ağrı uyaran (örneğin kuyruk tutam) yanıt vermiyor emin olun.
4. Kuru havaya maruz kalmayı önlemek için, farenin gözleri kapatmak için yapay gözyaşı jeli kullanın.
5. Bir elektrik ustura kullanarak, saç f kaldırmakrom baş ve hem de uyluk. 2 dakika uyluk saç çıkartıcı (örneğin Nair) uygulayın ve ardından kalan saç kaldırmak için dikkatlice silin. Bu, uyluk oksimetri için kullanılacaktır.
6. Bir 10% povidon-iyot solüsyonu ve% 70 etanol ile kafa derisi dezenfekte.

2. Açık kafatası kafatası pencere hazırlanması

1. Kafatasına kaudal 5 mm başlayarak, makasla saçlı bir kesi yapmak ve bir santimetre ilerlemek. Kafatası açığa taraf için cilt taşıyın.
2. Kafatasının üst membranlar kaldırmak için kafatasının üst% 10 demir klorür çözümü uygulayın. Fazla solüsyonun dindiriniz ve 45 ° açı # 5 cımbız ile uzak membranlar kazıyın. Bu baş plakası güvenli bir şekilde (adımları # 4-6) kafatası eklenebilir sağlamak amacıyla, dikkatle sitesi hazırlamak için önemlidir.
3. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, ilgi alanlarını belirlemek. Kraniyal sütürler kaçınılmalıdır unutmayın, çünkü kafatası cBir bu doğrultuda unpredictably bölünürler.
4. Kafası plakanın penceresi (Şekil 1) kenarlarında hızlı yapıştırıcı ince bir tabaka (örneğin Locktite 454) uygulayın. Ilgi alanı penceresinde maruz kaldığı şekilde kafası plakası yerleştirin. Kafa plaka üzerinde hafif bir basınç uygulayın. Hızla tutkalın polimerize etmek diş çimento küçük bir miktar geçerlidir. Tutkal polimerize ederken 10 saniye tutun.
5. Kafa plakası ve kafatası mühürlemek için pencerenin kenarları hızlı tutkal küçük bir miktar geçerlidir. Diseksiyon kapsamında hayvan sahibine kafa plaka vidalayın.
6. 6000 rpm ve bir IRF 005 matkap ayarlanmış Microtorque II matkap kullanarak, kafatası ve kafa plaka tüm ekstra tutkal kaldırın. Aksi Cam örtü eki engel olacağından kafa plaka üzerinde kalan herhangi bir tutkal, çıkarılmalıdır.
7. 1000 devirde matkap ayarlayın ve çapı ~ 5 m, kafa plaka penceresi içinde bir daire yaparak kafatası delme başlatmakm. Eğer çok yumuşak kurşun kalem ile çizim sanki ışık süpürme hareketleri kullanın. Basınçlı hava ile kemik tozu almak için her 20-30 saniyede bir delme durdurun.
   Not: kafa plaka açılış şekli dairesel bir kafa pencere oluşturmak için kolaylaştırır matkap ucu (sol ve sağ elini cerrah için), ek erişim sağlar. Buna ek olarak, iki tek biçimli delikler ilave polarografik ya elektrofizyolojik ölçümler için kafatası penceresi altında beyin doku içine bir Clark-elektrot veya cam elektrot eklemek için gerekli alanı sağlar.
8. Delme ilerledikçe, bir yuva merkezinde bozulmadan kafatası etrafında meydana gelir. Inceltilerek kafatası yoluyla poke, ancak bu bile kalınlığı bu yuva yapmak için dikkatli olun. Büyük damar-onlar bozulmaması ve mümkünse, hatta dokunulmaz olmamalıdır çevresinde ekstra dikkatli olun.
9. Pencerenin ortasında ("off fiske") kemik kaldırmak için cımbız # 3 biri "bacak" kullanın. Sunni bir damlapenceresinde ial beyin omurilik sıvısı (aCSF).
10. Hafifçe yumuşak doku kâğıdın bir köşesine (örneğin Kimwipe) kullanarak aCSF silin. Genellikle dura penceresinin kenarı etrafında bir veya daha fazla yerde bozulmuştur. Bu sitelerden birini başlayarak, hafifçe kaldırın ve sonra 45 ° açılı cımbız # 5 kullanarak, beyin yüzeyindeki dura çıkarın. Dura kaldırarak başlamak için adresinden site seçerken, büyük damar bitişik alanlarda kaçının. Kanama oluşursa, aCSF bir damla uygulamak ve durdurmak için küçük kanama için 2-3 dakika bekleyin.
11. % 0.07, düşük erime aCSF içinde çözülmüş agaroz) vücut ısısına eritilmiş agaroz getir hazırlayın. Beynin yüzeyinden aCSF fazlalık dindiriniz. Penceresinde agaroz dökün ve bir cam slayt ile kaplayın. Cam ve kafa plaka arasında bir temas kurmaya hafifçe cam basın ve agaroz katı kadar 10-20 saniye bekleyin.
12. Cımbız ve yumuşak doku kağıt kullanarak cam kapak aşırı agaroz çıkarın.
13. Küçük bir koyuntutkal kafa plakasına cam cam yerinden hızlı tutkal miktarı. Tutkal (Şekil 1) katılaşmaya diş çimento az miktarda uygulayın.

3. İntravenöz enjeksiyon ve kan oksijenlenme izleme

Not: Biz rutin intravenöz Texas kırmızı uygulaması yerine kuyruk veni için femoral ven kullanıldı. Femoral ven enjeksiyonu boya güvenli ve tekrarlanabilir bolus enjeksiyonları sağlamak olmasıdır.

1. Kısmen sol uyluk iç ortaya çıkarmak için aşırı hayvan çevirin. Bu pozisyonda hayvan sabitlemek için bant kullanabilir.
2. Antiseptik fırçalama ve sonra cilt% 100 etanol de geçerlidir.
3. Diz pubis eklemi için medial uyluk boyunca bir kesi yapmak. Cımbız # 5 kullanarak künt diseksiyon ile ayırın yumuşak dokular.
4. Texas Red (2.5 mg / ml), 130 ul 1 ml şırınga doldurun. Yeni bir iğne (gösterge 30) takın ve konik uydurarak, 30 ° dikkatlice kıvırın. Iğne wi doldurunth Texas Kırmızı çözüm.
5. Bir diseksiyon mikroskobu altında, femoral ven içine iğne takın ve Texas Kırmızı 100 ul enjekte. İğneyi çıkarın ve hafifçe kanamayı durdurmak için gazlı bez ile ven basın.
6. 4-0 sütür kullanarak cilt kapatın.
7. Kan _SpO2 sürekli izlenmesi (yeterli kan oksijenasyonu sağlamak için) sağ uyluk (hangi saç önceden kaldırıldı) üzerinde oksimetre probu yerleştirmek için.

4. İki foton görüntüleme

Not: Bir uyarım kaynağı olarak Sa lazer: Biz bir Spectra-Fizik Maitai HP DeepSee femtosaniye Ti ile Olympus Fluoview1000 multiphoton görüntüleme sistemi (dik) kullanın. Görüntüleme için, biz × 10 NA 0.45 (Zeiss C-Apochromat) veya × 25 NA 1.05 (Olympus XLPlan N) su daldırma hedefleri kullanın. Biz 512 bir çözünürlük × 512 piksel piksel 2 ms'den bekleme süresi de 12-bit derinliğinde görüntüleri çekin. NADH ve Texas-Kırmızı-dekstran aynı anda 740 nm'de uyarıldığı ve flor edilirescence bir dikroik ayna / yakın IR-engelleyici filtre kombinasyonu kullanarak ikaz ışık ayrılır (FF665-DI01; FF01-680/SP, Semrock, Rochester, NY, ABD) bir dikroik ayna kullanarak iki kanal ayrılmıştır (505DCXRU, Chroma , Rockingham, VT, ABD), ve bandpass (NADH-Semrock FF460/80Texas-Red-dextran-Semrock FF607/36) süzülür. Amaç sonra ölçülen Lazer güç katmanı I görüntüleme ve katman II görüntüleme için 20-50 mW için 10-20 mW olarak ölçüldü.

1. Mikroskop sahneye cerrahi hazırlanan fare aktarın. Yüksek büyütme iki foton anjiyografi ile kayıt için bir referans haritası olarak kullanmak 4x büyütme ile aydınlık alan aydınlatma kullanılarak kranyal pencere sitenin bir ilk fotoğrafını çekin.
2. × 10 büyütmede kullanarak ilgi alanda yakınlaştırma. Kortikal tabakalar halinde bir ilgi alanı seçin I veya II (pial yüzeyinden 150 mikron). Yüksek büyütmede arzu edilirse, x 25 hedefi kullanımı
3. (Figu zaman serisi kayıt Başlat) 2 yeniden. Biz görüntü kalitesini artırmak için 3-5 kare ortalama kullanmanızı öneririz.
4. Hayvan solunum olduğu hava 50% N2 ekleyerek hipoksemi indüklemek. Bu% 10 O2 seviyesi getirecektir. Oksimetre verileri izleyerek hipoksemi doğrulayın.
5. Hipoksemi (örneğin, 30 saniye) ile zaman serisi kaydetmeye devam edin ve normal O2 seviyesi geri yüklendikten sonra.
6. , Tespit ölçme ve kan damarları çevresinde hipoksi ve oksijenli doku silindir alanı miktarının tarafından oksijen dağılımının hesaplanması için veri toplamak.

5.. Veri işleme

1. Krogh doku silindir yarıçapı R. Bu kan damarının merkezi ve yüksek NADH floresans tespit edildiğinde hangi sınırı arasındaki mesafe ölçülerek (Şekil 3) elle de yapılabilir belirleyin.
2. Alternatif olarak, doku silindirin yarıçapı R hesaplama araştırmacı bağımsız yarı otomatik belirlenmesi ve merkezi blo kullanınek formu daha önce ¹ açıklanan ve bu protokol tartışma bölümünde özetlenmiştir od damar r.
3. Açık erişim görüntü analiz yazılımı, örneğin ImageJ kullanılarak hipoksi bölgeyi belirlemek. Bunu yapmak için, yükseltilmiş NADH doku floresans ile alanı ölçmek sonra yüksek NADH yoğunluğu alanı delineates bir eşik tanımlamak, NADH sinyal kullanmak ve.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 2 geçici hipoksemi (Bu Şekil PDF versiyonu için, seçilen fotoğraflar kullanılmıştır) sırasında NADH / anjiyografi görüntüleri bir video gösterir. Oksijen konsantrasyonu 3 dakika süreyle% 21 den% 10 'e düşürülmüştür edildi. Deneysel hipoksemi Bu düzeyde serebral korteks şiddetli hipoksi ikna etmek için yeterlidir. Hipoksi arteriyel kan kaynağından uzak olan bölgelerde başlangıçta, NADH floresan bir artışa yol açtı. Keskin NADH doku Notkortikal mikro oksijen difüzyon gözlemlenebilir doku sınırları temsil sınırları. Şekil 3 içinde görüntü serebral damarları çevreleyen oksijen difüzyon sınırların geometrisi gösterir. Bu, daha önce tarif edildiği gibi ^1, bu sınırların gelen silindir çapı Krogh anlamak için mümkündür.

Şekil 1. Görüntüleme için hazırlanan kraniyal pencere ile (A) Fare. (B) baş plaka boyutları.

Şekil 2. Endojen NADH yeşil floresan yaklaşık 50 um pial yüzeyinin altında, kranial pencereden iki foton görüntüleme ile görüntülendi. Kan damarları Texas Red dekstran görselleştirilmiştir. Solunan havadaki oksijen 3 dk süreyle% 10 düşürüldü, sonra% 21 için restore edildi. Ölçek çubuğu: 50μm.

Şekil 3. NADH floresans sınırları Geometri. Sarı anahat fonksiyonel hipoksi sınırı gösterir; mavi daireler tahmin oksijenli (Krogh) silindir göstermektedir. Mavi çizgiler silindir yarıçapları gösteriyor; numaraları mikrometre olarak yarıçapları gösteriyor.

Tartışma

Oksijen difüzyon hakkında yüksek uzaysal çözünürlüğü bilgilerin beyindeki kan akışını beyin hücreleri için oksijen sağlamak, ve metabolik talebi karşılamak için nasıl düzenlendiği anlamak için önemlidir. Clark-tarzı cam elektrotlar kullanılarak Geleneksel polarografik oksijen ölçümleri invaziv ve düşük uzaysal çözünürlüğü ^2-3 ve önemli (ikinci aralık) tepki süresine sahip. Şimdiye kadar beyin dokusunda pO ₂ ölçmek için sadece non-invaziv yöntem heyecanlı prob çürüme oranı oksijen konsantrasyonu ⁴ orantılıdır fosforesans su verme vardır. Bu yöntem, doğru oksijen konsantrasyonu sağlar, ancak özel bir boya ve bir teknik olarak gelişmiş fosforesans ömrü görüntüleme sistemi gerektirir. Burada, iki flurescence kanalları ile standart bir iki foton görüntüleme sistemi üzerinde yapılabilecek basit, basit bir yaklaşım göstermektedir. Bizim yaklaşımımız içsel bir doku sinyali ⁵ yararlanırnd sadece kortikal mikrodolaşımında zıt görselleştirme gerektirir. Çünkü fonksiyonel oksijen konsantrasyonu ¹ sınırlamaya NADH floresans doğrusal olmayan, esasen ikili artış, içsel NADH floresan tek anlamlı, metabolik sınırlayıcı hipoksi ile yerlerde görülmektedir arttı. Önemli bir ima kortikal mikrodamarlar oksijen difüzyon doku sınırları doğrudan endojen NADH floresans silindirik şeklindeki yoğunluğu değişiklikler gözlenebilir olmasıdır. Bir kan damarı çevreleyen doku oksijenli hacmi tanımlamak silindirik şeklindeki yapılar kavramı Ağustos Krogh tarafından ortaya atıldı ve son zamanlarda deneysel iki-foton NADH görüntüleme ¹ kullanarak gözlenmiştir, çünkü Krogh silindir gibi bu yapıların bakın. Krogh silindir görüntüleri görüntü kareleri bir z-yığını alarak 3D toplanabilir. Bunlar delici arteriyoller çevresinde, özellikle belirgin olup münasip wit olanh tükenmiş periarteriolar doku silindir ^1,4 kısımdır.

Krogh doku silindirin yarıçapı R objektif bir tespiti (Bölüm 5.2) biz silindir merkezi ve Matlab işlevi "improfile" kullanarak dış sınırı arasındaki iyi tanımlanmış bir kesimi içinde radyal piksel yoğunluk değerleri ölçülür sağlamak. Segmentin dış sınır görünür sınır ötesinde bir güvenlik payı ile genişletmek için tercih edilmelidir. Sinyal-gürültü düzeyini geliştirmek için biz 1 ° adımlarda görünür silindir kesimi kapsayacak şekilde gerekli tüm radyal hatları üzerinden averageed. Segmenti içinde çıkan ortalama radyal yoğunluk profili görünür doku sınır R karşılık dik bir artış sergiledi. Biz ortalama radyal yoğunluk profili için bir sigmoid fonksiyonu (örn. Boltzmann fonksiyonu) uyacak ve R bir tanımı olarak dönüm noktası (ayrıca x ₀ olarak da bilinir) kullanılır. Karşılık gelen iki-pHoton microangiography (Texas-kırmızı) silindir merkezinde bir tek merkezi damar ve kesiti göstermektedir. Merkezi damar çapı doğrudan r belirlemek için de uygulanabilir.

İki foton NADH görüntüleme kortikal microangiography eş zamanlı yüksek çözünürlüklü görüntüleme aynı uzaysal çözünürlüğü sağlar. Bu yöntemin kantitatif uygulama için önemli bir özelliği, p NADH floresans artış ₅₀ 3.4 arasında olduğu ölçülmüştür olmasıdır ± 0.6 mm Hg ¹ ve ₂ microregional doku pO bir fonksiyonu olarak NADH floresans yoğunluğunu matematiksel olarak tarif edilebilir bir sigmoidal fonksiyonu. . Bu tekniğin bir hipoksi (% 10 havadaki oksijen miktarının azalmasıyla tarafından) en savunmasız olduğu beyin alanları belirlemesine olanak sağlar göstermektedir. Biz de oksijen difüzyon basit bir geometrik perivasküler bir yol izler olduğunu göstermektedir.

Bir critBu yöntem için ical adım kraniyal pencere hazırlık kalitesidir. Cerrahi maruz bölgeye kan akışını rahatsız etmemek için asgari zararla üretmek gerekir. Bir endişe bir cerrahi tehlikeye hazırlanmasında, pencerenin altında kortekste anlamlı bir deney engellediği bilgisi, başlamak için hipoksik olabilir olmasıdır. İyi hazırlanmış kafa penceresi tüm gemi tiplerinde canlı kan akımı ve kenarlarında belirgin kanama ile bozulmamış büyük ve küçük kan damarları olmalıdır. Normoksik koşullar altında (PaO2 80-100 mmHg, Sp O2% 97-99) beyin dokusunda yüksek NADH floresan ile göze çarpan, parlak doku yamalar olmadan tek tip, homojen NADH floresan sergilemesi gerekir.

Bizim yaklaşım temel bir fiziksel kısıtlama derinlemesine nüfuz sınırlıdır. Beyinde mavi-yeşil NADH floresans bu dalga boylarında hemoglobin emilimi ve doku saçılma hızla azalırlar. Hatta yüksek sayısal açıklık ile (örneğin 1.05) suDaldırma amaçları iki-fotonlu NADH görüntüleme anda kortikal tabakalar I ve II ile sınırlıdır. Ya da beyaz cevher yakınlık enerji metabolizmasını olasılıkla gri madde farklı olacaktır, çünkü bu sınırlama bilimsel olarak geçerlidir. Bununla birlikte, bu tabakalar IV-VI ya da beyaz madde yolları veya striatum olarak subkortikal yapılar gibi derin kortikal yapıların incelenmesi olarak vivo ⁶ fare korteksi açıklanan özel mikromercekten kullanımını gerektirir.

Bu tür fonksiyonel hiperemi ve kapiller akı oranlarının tespiti ⁷ analizi gibi diğer ölçümler ile bir araya geldiğinde oksijen difüzyon sınırları NADH tabanlı ölçümü özellikle yararlı olabilir. Örneğin, bu teknik felç, Alzheimer hastalığı (AD) modellerinde hipoksi canlandırmak için adapte edilebilir. Oksijen difüzyon basit bir geometri bir kapiller yoğunluk de olduğu koşullarda mikrovasküler yatak oksijen gradiyenti tahmin sağlar⁸ (örneğin, MS ⁹⁾ artmış ve azalmış kapiller yoğunluğu ile beyin dokusu bölgelere microstrokes nedeniyle hipoksi hasar riski olup olmadığını incelemek. Dokunun hipoksi ve müteakip nöronal ölüm ya da kılcal remodeling ¹⁰ arasındaki görüntü yeteneği microregionally ayrıca bir doku microstrokes geometrisi ve boyutu incelemek ve hipoksi oluştuğu doku hacmi belirlemek için olanak sağlar, hem de ilişki.

Endojen NADH floresans artışlar akut mitokondriyal disfonksiyon doğrudan sonucu olduğundan Son olarak, bu yöntem sinir enerji metabolizması ¹¹ ve mitokondriyal disfonksiyon için bir proxy için belirli bir muhabir olarak NADH görüntüleme kullanma fırsatı yaratıyor.

Sonuç olarak, endojen NADH floresans iki-fotonlu görüntüleme hem normal altında beyinde oksijen ve tüketim anlamak için kullanılabilecek bir basit, talepkar olmayan bir araçtırve patolojik eyalette.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar (isteğe bağlı)
Isıtma pedleri	Bodi Isı Ötesinde
Oftalmik merhem (suni gözyaşı)	Pfizer
Povidon-iyot% 10 çözüm	Betadine
Ferrik klorür çözeltisi% 10
Çimento	Şirket Stoelting	51456
Siyanoakrilat 454	Loctite'a
aCSF	Harvard Apparatus	597316
Microtorque II başlık seti	Pearson	R14-0002
IRF 007 matkap	Güzel Bilim Araçları	19008-07
Forseps # 5	Güzel Bilim Araçları	11295
Forseps # 5/45	Güzel Bilim Araçları	11251-35
# 0 cam coverslip	Elektron Mikroskopi Bilimleri	63750-01
Photomultiplier tüp	Hamamatsu	HC125-02
Ti: Safir lazer Mai-Tai	Spectra-Fizik