γ-herpesvirüslerinin (γ-HVS) ev sahibi ömür boyu kalıcılığı kurmak. Enfeksiyon γ-HV68 ile farelerin genetik çözülebilir sağlar In vivo ΓHVs ömrü / patogenezinde karakterizasyonu modeli. Bu protokol, plak oluşturan, bulaşıcı merkezi, ve qPCR deneyleri enfeksiyonu takip eden akut ve latent aşamasında γHV68 enfeksiyon tespit ve kantitatif açıklamaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
γ-herpesvirüslerinin (γ-HVS) lenfoid hücrelerde 1 latent enfeksiyonlar kurmak için yeteneklerini dikkat çekicidir. EBV ve KSHV insan olarak γ-HVS, dar ana aralığı ciddi detaylı patojenik çalışmaları engellemiştir. Murin γ-herpesvirus 68 (γHV68) hisse senetleri γ-HVS insan ve yaygın genetik ve biyolojik benzerlik murid kemirgenler 2 doğal bir patojen . Viral enfeksiyon farklı aşamalarında fareler kendilenmiş suşları γHV68 enfeksiyon gibi, değerlendirme sırasında viral yaşam döngüsü ve γ-HVS enfeksiyon patogenezinde anlamak için önemli bir model sağlar.
Intranazal aşılama üzerine, daha sonra dalak ve diğer hücrelere, ev sahibi 3,4 ömrü boyunca yeniden olabilir gizli bir enfeksiyon, akut akciğer viremi γHV68 enfeksiyonu sonuçları çözümlenir bu. Bu protokol, biz eşek plak testinin nasıl kullanılacağını anlatacağızpost-intranazal enfeksiyonu (dpi) - akciğer bulaşıcı bir virüs titresi erken evre (7 gün 5) Vero hücre mono tabakaları homojenatlarında. Akut enfeksiyon, büyük ölçüde 2 temizlenir, 3 hafta postinfection γHV68 bir latent enfeksiyon 14 dpi etrafında kurulan ve daha sonra farelerin dalak tutulur. Gizli virüs enfeksiyonu genellikle uykuda kalır ve onun gen ekspresyonu çoğu kapanır sayede enfekte dokular, hücrelerin çok küçük bir nüfus etkiler. Latent enfekte splenositlerin kendiliğinden virüs, viral gizli yükü belirlemek için bulaşıcı bir merkezi (IC) yöntemi ile değinmeyecek olabilir doku kültürü içine explanting sonra yeniden etkinleştirin. Akut ve / veya latent enfekte dokular, kantitatif real-time PCR viral genomun kopya miktarını hesaplamak için (qPCR), maksimum hassasiyet ve doğruluk için kullanılır. QPCR ve plak tahlil ve / veya IC tahlil sonuçlarının kombine analizler, viral Spatiotemporal profillerini ortaya koyacaktırin vivo çoğaltma ve enfektivite.
Protokol
Aşağıdaki protokol teorik γHV68, benzer yaşam tarzı paylaşan diğer virüsler tarafından enfeksiyona değerlendirmek için kullanılabilir farelerde γHV68 litik ve latent enfeksiyon döngüsü, virüs titreleri ve viral genomun yükler çalışma anlatacağız.
1. ΓHV68, amplifikasyon
- 37 ° C su banyosunda γHV68 donmuş bir flakon çözülme.
- 37 NIH3T12 veya 3T3 hücre kültürü (~% 50 confluency) 10 cm yemekleri ve kültürü enfekte olmuş hücrelerde virüs inoculums ° C,% 5 CO 2.
- Sitopatik etki (CPE) mikroskopi, kültür inceleyin ve hücrelerin% 80 den daha büyük CPE 4 ~ 5 gün sonra enfeksiyon eklendiğinde, bir anda medya t....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
γHV68 yaygın insan γ-HVS 2,4,5 patogenezinde anlamak için bir model olarak kullanılmıştır. Bu protokol, farelerde intranazal aşılama sonrası γHV68 akut ve latent enfeksiyon değerlendirmek, plak için bulaşıcı bir virüs titresi tahlil, viral gizli yük için IC tahlil ve viral genomun yük için qPCR olmak üzere üç rutin olarak kullanılan yöntem tanımlanmıştır.
Plak testi, enfekte olmuş hücrelerde ya da dokularda virüs titresi belirlemek için yaygın olarak kullanılan, ancak virüs olduğu.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Yazarlar, teknik danışmanlık ve destek Ren Sun (University of California, Los Angeles) ve Seungmin Hwang (Washington Üniversitesi) kabul etmek istiyorum. Bu çalışma, Baxter Vakfı, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri (C. Liang R01 CA140964 ve R21 AI083841) tarafından finanse edildi.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Malzeme Adı | Hazırlama Prosedürü | ||
| Viral plak testi için Metilselüloz (MC) bindirme orta |
| ||
| Düzeltme / plak testi için orta leke | % 0.2 (w / v)% 20 etanol içinde kristal viyole. | ||
| ACK Lizis Tamponu | NH 4 Cl 0.15m, KHCO 3 10mM EDTA 0.1mm | ||
| Komple DMEM | Dulbecco'nun modifiye Eagle orta2 mM L-glutamin, ve% 1 penisilin-streptomisin (Gibco-BRL) (DMEM)% 10 fetal sığır serumu (Invitrogan FBS) ile desteklenmiştir. |
Bu protokolde kullanılan Tablo 1: Belirli medya
| Reaktifi Adı | Şirket | Katalog numarası |
|---|---|---|
| Ketamin | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Metilselüloz | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Yaşam Teknolojileri | 11935 |
| Hücre süzgeç | BD Faclon | 352340 |
| Omni doku homojenizatör | OMNI Uluslararası | TH115 |
| DNeasy Kan ve Doku Seti | Qiagen | 69504 |
| iQTM SYBRH Yeşil Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 real-time PCR sistemi | Bio-Rad | 184-5072 |
| Hücre sayıcı | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Tablo 2: Belirli reaktifler ve ekipman
Kaynaklar
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
