Kombine Genomics metabolomiks ve Bilişim ile Bitki Gen Fonksiyonu ek açıklama

Özet

Metabolizma aracılığıyla genomik, co-geni ifade analizi ve hedef bileşiklerin tanımlama kombinasyonu genin işlevsel bir açıklama verir.

Özet

Tam genom dizileri mevcuttur ve böyle nakavt mutantlar, yabani katılmalar ve gelişmiş üreme popülasyonları gibi biyo-kaynakların bolluğu hangi modeli bitki türlerinin sürekli genişleyen sayısı göz önüne alındığında, gen işlevsel açıklama için yükselen bir yük vardır. Bu protokolde, birleşik ortak ifade gen analizi kullanılarak bitki gen fonksiyon açıklama, metabolomik ve bilişim (Şekil 1) sağlanır. Bu yaklaşım, metabolomik vasıtasıyla hedef bileşiklerin tanımlaması ile birlikte belli bir metabolik proses dahil olmak üzere non-açıklamalı genlerin tanımlanmasını sağlamak için bilinen olasılıkla fonksiyonunun hedef genlerin kullanılarak teorisi dayanmaktadır. Stratejileri zahmetsiz olan bu hiçbiri rağmen her iki ileri ve ters genetik yaklaşımlar tarafından oluşturulan nüfus bu bilgileri uygulamak için ortaya konulmuştur. Doğal sonucu olarak bu yaklaşım aynı zamanda, yeni ya da özel se temsil bilinmeyen zirveleri karakterize bir yaklaşım olarak kullanılabilirsınırlı dokuları, bitki türleri veya şu anda bitki metabolizması anlamak için önemli bir çalışmadır stres tedavisinin, içinde İkinci basamak metabolitleri.

Protokol

1. Numune Hazırlama

1. Bitki malzemeleri hasat ve hemen dondurulur.
2. Donmuş bitki malzemeleri -80 ° C'de karıştırıcı değirmen ile toz (veya harç) ve Falcon tüp veya Eppendorf tüp saklanır

2. Metaboliti Profilleme için Ekstraksiyon

1. Bir kısım 2 ml Eppendorf tüp bitki materyali donduruldu.
2. Donmuş bitki materyali taze ağırlık miligram başına ekstraksiyon tamponu 5 ul ekleyin.
3. 25 ls ^-1 2 dakika süreyle Mikser Mill ile bir metal (ya da gilconia) topu ekleyin ve donmuş toz homojenize.
4. 12,000 rpm'de 10 dakika santrifüj.
5. Santrifüj filtre NANOSEP için süpernatant aktarın.
6. 4000 devirde 2 dakika santrifüjleyin.
7. Kullanılıncaya kadar -20 ° C'de yeni Eppendorf tüp, ve mağaza için süpernatant aktarın.

3. LC-MS ile metabolit Profilleme

1. HPLC kurma ve kolon fırını ve örnek tepsi sıcaklığını kontrol edin.
2. MS durumu ayarlama ve vakum ve ısıtma kılcal durumunu kontrol edin.
3. MS dedektör m / z kalibrasyon gerçekleştirin.
4. LC-MS için özler 50 ul cam şişeye aktarın.
5. LC-MS ile hülasa 5 ul enjekte edilir.

4. Veri Analizi

1. Xcalibur veya Metalign ⁴ yapılandırın ve işlenecek veri analizi seçin.
2. Tablo I bileşik sınıfına göre ilgilendiğiniz tespit zirvelerinin bir tablo hazırlayın.
3. Standart bileşiklerin ortak elüsyon tarafından zirveleri tanımlayın.
4. Annotate MS ^2. analiz, literatür taraması, metaboliti veritabanı arama (Şekil 2, ^12,13) ​​kullanarak zirveleri algılandı.

5.. Metabolik Pathway Tahmini

1. Tespit edilen bileşikler ile bir yol oluşturmak mümkündür. Pik ek açıklamaları kullanarak yolun Tahmin tespit bileşiğin kimyasal yapısı dayalı olmalıdırmetabolik yolu ¹³ enzimatik fonksiyonlar bağlayarak tahmin ederek s. Yapılandırılması biyosentetik adımları hassas pik açıklama ile yapılmalıdır. Şeker parçası ve yaklaştırılmış pozisyonu öngörülmesi MS analizi ile tespit etmek çok zordur, çünkü, ancak detaylı kimyasal yapısı belirlenmesi, örneğin şeker yarısıdır için, bu basamakta vazgeçilmez değildir. Böyle hexoside ve pentoside olarak şeker tipinin belirlenmesi projenin son aşamasında şeker donör enzimatik tayini ile tespit edilecektir. Çoğunlukla yolunun oluşturulması tahmin küçük molekül gibi dehidrasyon tepki olarak, bazı durumlarda dışında büyük molekülün ara maddedir uygulanmalıdır. Örneğin atom molekül ağırlığı listesi, 16-H arasındaki farkın m / z-OH ve yarımı (oksidasyon), 14 m / z (Karbon atomuna) arasındaki farkın-OH ve-OMe (metilasyon) ve 162 m / z ( heksoz (glikozilasyon) için _MW-H2O), tahmin için yararlıdır. Belirlenmesidokuların özgüllükler korelasyon analizi ile modifiye tipi metabolik yolun tahmini yardımcı olur. Böyle KEGG veritabanı (genel metabolik yolun Veritabanı http://www.genome.jp/kegg/ ) ve PlantCyc ( http://plantcyc.org/~~V ), ilgilendiğiniz metabolik yolun tahmini için çok etkilidir.

6. Arabidopsis Orthologous Gen ID ile gen listesi hazırlanması

1. Genomik veritabanından gen ID listesi indirin.
2. , Orthologous gen Arabidopsis gen ID ekle hedef bitki durumunda Arabidopsis değildir.
3. Senin yolun-of-ilgi genlerin bir listesini hazırlayın. Arabidopsis yolu veri ve gen ailesi veri Annotation TAIR web sitesi (mevcuttur http://www.arabidopsis.org/~~V ). Eğer Arabidopsis orthologous genlerin bir liste hazırlanmış ise, sonradan kombi yapabilirsinizne onları.

7. Co-ifade Gen Analizi

1. Senin yolun-of-ilgi (Tablo II) iyi bilinen gen çiftlerini kullanarak korelasyon kontrol ederek yol için en iyi veritabanı aramak için hazırlanmış gen ID listesini kullanarak test edin. Co-ifadesi veritabanı veya gen ifadesi veritabanı ilgilendiğiniz fabrikasında mevcut değilse, Arabidopsis ortak ifadesi veritabanı Arabidopsis orthologous genlerin bir listesi ile birlikte kullanılmalıdır. Arpa durumda, pirinç, kavak, buğday, Medicago ve soya fasulyesinden, bitki türlerinin co-ifade analizi (Tablo II) de kullanılabilir.
2. Senin yolun-of-çıkarına bilinen genlerin bağlantıları dayalı Hedef ortak ifadesi ağ için bir çerçeve oluşturmak.
3. Ilişkili aday genler (sizin yolu-of-çıkarına bilinen genlerin bağlantıları arasında katsayı değerinin yaklaşık değeri içinde r <0.4 ~ 0.90,) ekleyin ve pr kendi gen açıklama kontrolEn iyi aday genler (Şekil 3) bulmak için bu ağ bağlantıları edicted aileleri. Katsayısı değeri eşik ilişkili genlerin ağ yapısı ve yoğunluğuna göre koordine edilmelidir.
4. Sizin hedef patika için özel olarak daraltmak edebiliyoruz genlerin listesini yapın.
5. Lütfen aday genlerin organ özgüllükleri ve stres yanıtlarının gen ekspresyonu kontrol edin.

8. Yeni tanımında tahmin Tüm Bilgi Entegrasyonu

1. Tahmin edilen metabolik yolu eş-ekspresyon analizi sorgu için kullanılmış olan iyi karakterize genler ekleyin.
2. Bu yolda uncharacterized parçaları kontrol edin, örneğin enzimatik adımları, taşıyıcı proteinler ve transkripsiyon faktörleri uncharacterized.
3. Bu eksik uncharacterized adımlar için en uygun gen açıklama tahmin.
4. Silico ge konusunda metaboliti profilleme ve aday genler sonuçlarını birleştirmekne ifade tahmin yolu dayalı.
5. Oksitlenmiş bileşik için P450, glikozit için asetillenmiş metaboliti, glycosyltransferase için asetiltransferaz örneğin gen işlevine göre tahmin edilen yolun, üzerinde aday genler düzenleyin. Amino asit dizilerinin analizi Filogenetik ağaç P450 ve glycosyltransferase gibi bazı geniş bir gen ailesi için yararlıdır.
6. Metabolit birikimi ve aday genlerin gen ekspresyon düzeyi arasında doku özelliklerine ya da stres yanıtların tutarlılığını kontrol edin.
7. Substrat ve strese duyarlı genler sağlamak için diğer metabolizma bağlantılarını kontrol edin.

9. Bio-Gen kaynakları kullanma belirlenmesi için deneyler

1. Aday gen tespiti için deney kolaylaştırılması için bioresources kullanılabilirliğini kontrol edin.
2. Böyle KO mutant kütüphane ve tam uzunlukta cDNA kütüphanesi olarak biyo-kaynaklar kullanılarak gen fonksiyonunun belirlenmesi için bir deney yapın. Taşırı bitki ve nakavt mutantlar, enzimatik assay ve organizatörü bağlanma analizi hazırlanması ile genlerin fonksiyonel tanımlama için o deneyler, sizin tahmini en iyi aday genler için yapılmak zorundadır. Protein özellikleri karakterizasyonu ve bu dönüşüm için rekombinant protein ve gen klonlama hazırlamak için oldukça uzun sürer bu yana KO mutant kullanarak metabolit profil onay alındıktan sonra yapılması daha iyi aşırı bitkilerin hazırlanması için Rekombinant protein tayini.

10. Temsilcisi Sonuçlar

Bu protokolde belirtilen entegre analiz prosedürü belirtilen deneysel amaçlı ve biyolojik ve analitik kombinasyonları tercihi bağlı olarak pek çok olanak vardır. Usul ve deneysel tasarım seçimi hedef yolu, bileşikleri ve bitki türlerinin temelinde düzgün yapılmalıdır. Bu protokolün açıklanan entegrasyon stratejisi foc olduğunu birçok biyo-ve veri kaynağı etkin bir şekilde kullanımı ile bitki gen fonksiyonu ve yeni gen fonksiyonlarının keşif açıklama kullanılır. Beklenen sonuç kesin tahminin tek vaka ile sağlamak için söz edilir. Bu durum yeterli delillerin birlikte profilleri tarafından verilen mümkün değilse, deney başladı gerektiğini gösterir. Bu nedenle, her durumda, RT-PCR ile hedeflenen örneğin gen ifadesi profili gibi ek ön deneyler, gen fonksiyon için tahmini destekleyebilir. Tahmin Doğruluk ve doğruluğu yüksek kombinasyon değişimi nitel farklılıklar ve sayısına bağlı olarak ilişkilidir. Ayrıca, iyi bir aday ve geçerli sonuçlar sadece yolların doğru bir şekilde tahmin gelebilir. Tepe açıklama Örneğin literatür araştırması, referans bitki özü, MS ⁿ analizi, organ özgüllük ve mutant analizi ^13, çeşitli yaklaşımların kombinasyonu ile yapılmalıdır.

1 "src =" / files/ftp_upload/3487/3487fig1.jpg "/>
Şekil 1.. Kombine yaklaşım ile gen açıklama deneysel akışının bakış. Bazı durumlarda, proje özel şartlar veya dokularda tespit edildiğinde yeni bir zirve, ve metabolizma içinde rolünü anlamak arzusu keşfi ile başlar. Diğer durumlarda ise projenin amacı gibi transkripsiyon faktörleri gibi önemli düzenleyici faktörlerin gen tanımlama ya da bir bulgudur. Deney Tasarımı farklı organlarda doku örnekleri geniş bir yelpazede kullanarak hedef yolunda metabolit düzeylerinin belirgin farklılıklar gösteren bir veri seti ile rendelenmiş, ve stres koşullarına maruz ayirt bitkilerin veya bitkiler için ve malzeme tabi olmalıdır metabolit profil. Mutant ve transgenik bitkilerin yanı sıra QTL barındırılmasının ıslah materyali de bu çalışmalar için uygun genetik materyali temsil eder. Roman yolunun Tahmin doğru dikkatlice yapılmalıdırörneğin yolu-of-ilgi gen ekspresyon verilerine göre organı menkul ve stres tepkileri gibi metabolotype farklı türü ile pik açıklama ve kombine yaklaşım. Son adım olarak, metaboliti ve transkript profilleme sonunda, web kaynakları silico analizi ve heterolog ifade ile gen ekspresyonu in vitro karakterizasyonu ile bir araya geldiğinde, onun işlevinin gen adayı ve aydınlatılması teyidi yol hangi yapılmalıdır ve metabolik yol içinde pozisyon. Kısaltmalar: QTL, Kantitatif Sürekli Loci.

Şekil 2. Pik, not almak için kombinezonsal yaklaşımın İş akışı. Pik tanımlama ve açıklama standart bileşik tarafından, vahşi tip karşılaştırılması ve mutantlar knock out için bir prosedür, hedef zirve çok boyutlu kütle spektrometresi saf com kitle spektrumu sözveritabanları ¹² pound. Kısaltmalar: DB, veritabanı; KO, knock-out, 1-D, tek boyutlu, 2-D, iki boyutlu, NMR, nükleer manyetik rezonans, IR, kızılötesi, MS ^n, kitle-kütle spektroskopisi.

Şekil 3. Antosiyanin yolun Örnek ortak düzenleme ağ analizi. Koekspresyon analizler Prime (kullanılarak yapıldı http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index 3 ^8,2 ATTEDII sürümü belirlenen verilere dayanarak) Pajek programı ( http://vlado.fmf.uni-lj.si/pub/networks/pajek/ ). Pozitif korelasyon (r <0.5) ağ bağlantıları yapmak için kullanılır. Kırmızı düğümü: oniki antosiyanin enzim genleri (At5g13930, CHS, TT4, chalcone sintaz; At3g55120, CHI, TT5, chalcone izomerize; At3g51240, F3H, TT6, flavanon 3-hidroksilaz; At5g07990, F3'H, TT7, flavonoid 3'-hidroksilaz; At5g17050, Fd3GT, UGT78D2, flavonoid 3 - O-glukoziltransferaz; At5g17220, AtGSTF12, TT19 ; At5g42800, DFR, TT3, dihydroflavonol redüktaz; At4g22880, ANS / LDOX, TT18, anthocyanidin sentez; At4g14090, A5GT, antosiyanin 5 - O-glukoziltransferaz; At5g54060, A3G2 "XT, olası antosiyanin 3 - O-glikozit 2" - O - xylosyltransferase; At3g29590, A5GMaT, antosiyanin 5 - O-glikozit 6'' '- O-malonyltransferase; At1g03940, A3GCouT, antosiyanin 3 - O-glikozit 6 "- O - p-coumaroyltransferase) ve antosiyanin üretimi için iki transkripsiyon faktörleri (At1g56650, PAP1; At1g66390, PAP2) aday genler aramak için kullanılan bir r katsayısı ile bir eşik değeri ile Aday genler bir "kümelerinin kesişimi" tarafından bulundu arama <./ Em sorgulanan tüm genler (Ondört antosiyanin biyosentetik genler) tarafından setleri kesişme tarafından sorgulanır 0.50 geçiniz. Ilişkili aday genler (68 genler) ve sorgulanan genleri (14 gen) içeren ortak ifadesi ağı, r> 0.50 PRIME veritabanı kullanarak bir "set arabağlantı" tarafından yeniden inşa arama oldu. PRIME veritabanı ve ağlardan bir '. Net' dosyası ile biçimlendirilmiş çıktı dosyaları Pajek yazılımı kullanılarak çizildi. Mavi düğüm antosiyanin genleri ile ilişkili aday genler gösterir.

tür	Binbaşı sekonder metabolit
Arabidopsis thaliana	Glukosinolat, flavonol, antosiyanin, sinapoyl türev
Populus trichocarpa	Flavonol, antosiyanin, salisilat türevi
Vitis vinifera	Flavonol, antosiyanin, tanen, stilben
Solanum lycopersicum	Flavonol, antosiyanin, glycoalkaloid, ilgili chrologenate,
Nicotiana tabacum	Flavonol, antosiyanin, nicotianamide, acylsugar ilgili chrologenate
Oryza sativa	Glycoflavone, antosiyanin, sterol türevleri
Zea may	Glycoflavone, antosiyanin, benzoxazinone, sterol türevleri
Medicago truncatula	İsoflavon, antosiyanin, saponin,
Japonica Lotus	İsoflavon, flavonol, antosiyanin, saponin,

Model bitki türleri Tablo I. Büyük sekonder metabolitleri.

Co-ifadesi veritabanı	Adres
Bitki çapraz specler
COP	http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/~~V
Planet	http://aranet.mpimp-golm.mpg.de/
Bitki türleri
ATEED-II	http://atted.jp/
BAR	http://142.150.214.117/welcome.htm
COP	http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop
GeneCAT	http://genecat.mpg.de/
Arabidopsis
ACT	http://www.arabidopsis.leeds.ac.uk/act/coexpanalyser
AthCoR@CSB.DB	http://csbdb.mpimp-golm.mpg.de/csbdb/dbcor/ath.html
CressExpress	http://cressexpress.org/~~V
PRIME	http://prime.psc.riken.jp/?action=coexpression_index
Oryza sativa
RiceArrayNet	http://arraynet.mju.ac.kr/arraynet/~~V
Rice Dizi Veritabanı	http://www.ricearray.org/coexpression/coexpression.shtml

Tablo II. Siliko ortak ifadesi analizi için mevcut gen ekspresyonu veritabanı.

Tartışma

Transkriptomik ve metabolomik teknolojiler birkaç yıldır kullanılmış olduğunu göz önüne alındığında, gen açıklama yardım metabolomik için veri entegrasyon süreci genellikle bilinmeyen bir metaboliti temsil eden yeni bir zirve belirlenmesi ile başlar. Bu gerçek metabolit zirveleri nicel Varyans veya biyosentezleri sorumlu olduğu düşünülen yeni aday genler değerlendirmektir sonraki aşamaya yol açar. Bu protokolün açıklanan strateji, ancak üç büyük sorunlar i) pik açıklama zorluğu, ii) yolu tahmini karmaşıklığı, iii) gen ekspresyonu veri geni bilgi ve kaliteli çözünürlüğe sahip. İlk sorunuyla mücadele için, pik açıklama standart bileşikler veya MS ⁿ analizi, referans özü, mutant analizi, metaboliti veritabanı arama ve literatür taraması (Şekil 2, ¹²⁾ Kombinatoryal yaklaşım kullanarak bilgi ko-elüsyon ile yapılmalıdır. Second sorunu, yolun tahmini tek doğru pik açıklama ile elde edilebilir. Metaboliti, ilgili birikimi genin gen ekspresyonu ile ilişkili alınmalıdır çünkü Ancak, doku spesifisite metaboliti profili, aynı zamanda, destek pik açıklama olabilir. Bu nedenle farklı dokular ve büyüme koşullarının kombinasyonu profilleri bu ikinci sorun için yararlı olabilir. Geni bilgi çözünürlüğü ile ilgili sorun, üçüncü sekansı verilerin bir ilerleme bağlıdır. Genom sekansı tamamlanmasından olmadan modeli bitki halinde, diğer modeli bitkilerde orthologous genler kullanılarak ko-ifade analizi yararlıdır. Amino asit dizisinin detaylı uyum karşılaştırma ve filogenetik ağaç analizi diğer türlere model organizmalar bağlamak için destek olabilir.

Bu protokol, tüm metabolizması için uygundur. Bu kadar güçlü transkripsiyonel c tabi olmaya karakterize orta ve ikincil metabolizmaları analizinde en verimliontrol ^1,5,11,16. Bazı örnekler, kükürt asimilasyon gerçekleştirilmelidir başardı co-ekspresyon analizi, β-oksidasyon, dallı zincirli aminoasit bozulması, klorofil arıza ve lizin katabolizması ³ genler, hücre duvarı metabolizmasını ^10,7 ve kaskad ¹⁴ sinyalizasyon ışığı. Kombine genomik, metabolomik ve bilişim yoluyla genin fonksiyonu Annotation transkripsiyon faktörünün biyosentez gen ve doğrudan regülatörü için aynı zamanda fizyolojik bir süreç ve yanıtı anlamak için değil sadece (örneğin Şekil 3. ^14).

Modeli bitkilerden bitki türleri için bu yaklaşım geliştirmek için, bitki türleri arasında metabolik karşılaştırılması bazı genel metabolizması güçlü bir yaklaşımdır. Aynı bileşik farklı bitki türü tespit ve Örneğin, bazı orthologous genler bu bitki türü bulunur, orthologous genleri kullanarak çapraz türlerin ortak ifade analizi stron sağlayabilirsizin tahmini için g desteği. Bu yaklaşım, ek olarak kavak, Medicago, Arabidopsis yapılabilir gibi bitki türlerinin co-ifade analizi ^(6, Planet'ten arpa, pirinç, buğday ve soya fasülyesi gibi önemli ekinler: http://aranet.mpimp-golm.mpg . de / ; ^9, COP: http://webs2.kazusa.or.jp/kagiana/cop0911/ ;), ¹⁵ bir örneğe bakın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Damıtılmış su ULC / MS grad	BIOSOLVE	23214102
Asetonitril (ACN) ULC / MS dereceli	BIOSOLVE	01204102
Metanol (MeOH) ULC / MS dereceli	BIOSOLVE	13684102
Sıvı kromatografisi için formik asit (HCOOH) ULC / MS dereceli	BIOSOLVE	06914131
Standart bileşikleri	Extrasynthese
Lineer iyon trap (BT) ESI-MS sistemi Finnigan-LTQ	Thermo Finnigan
HPLC sistemi Surveyor	Thermo Finnigan
C18 analitik sütun Luna (2), 2.0 mm çapa ve 150 mm uzunlukta, 100 bir gözenekboyutu ve 3 mm arasında dairesel parçacıklar	Phenomenex	00F-4251-B0
Xcalibur yazılım	Thermo Finnigan