$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Hücreleri Seeding
- Başlamadan önce, 37 az bir su banyosu içinde, kültür ortamı, PBS 1X ve tripsin ısınmak ˚ C
- Kuluçka hücrelerini alın ve orta aspire.
- 5 ml PBS 1X nazikçe yıkayın hücreleri geçerlidir.
- PBS 1X aspire tripsin EDTA% 0,025 içeren 1 ml uygulayın.
- Tripsin eşit bir dağılıma sahip olduğu plaka hafifçe döndürün.
- 37 inkübatör hücrelerin yerleştirin ˚ C (hücre tipine bağlı olarak 5-10 dakika). Zaman zaman kontrol hücreleri plaka sallayarak ayrılmış.
- 10-20 ml orta hücrelerin 50 ml şahin tüp içinde süspanse edin ve onları toplamak.
- Beckman sayacı kullanarak hücre sayımı. Hücrelerin sayısı yaklaşık% 60-70 oranında bir izdiham sağlamak için yeterli olmalıdır.
- Plate hücreleri ve 6-8 saat süreyle tohum onlara izin verir.
2. TransInfeksiyon
- Transfeksiyon için önce 37 ˚ C'ye bir su banyosu içinde bir kısım serum orta ısınmak
- X-treme Gen 9 oda sıcaklığına getirin.
- 2 Eppendorf tüpler serum serbest orta (1 tüp = 1 transfeksiyon) pipetleyin.
- Pipetleyin ucu, 5 dakika, Eppendorf ve inkübe plastik duvar temas edip etmediğini, serum serbest orta ödeyerek dikkat X-treme Gen 9. Bu arada iki DNA karışımlarını hazırlamak: Bir tüp içinde, başka bir tüp renilla, ateş böceği ve moleküler şaperon renilla, ateş böceği ve boş bir vektör kontrolü için plazmid karıştırın.
- + X-treme Gen 9, vortex ve 20 dakika oda sıcaklığında inkübe içeren serum serbest ortam her Eppendorf DNA karışımını ekleyin.
- 37, 24 saat boyunca her plaka ve inkübe üzerine damla damla her karışımı ° C ve% 5 CO 2
3. Yarma hücreleri
- 24 saat sonra transfeksiyon, tryps1.4 'de açıklandığı gibi hücrelere inize - 1.6 ve% 60-70 oranında son bir confluency 6 plaka onları sulandırmak.
- Olmayan şok kontrol için bir tabak hazırlayın ve analiz edilmesi gereken kurtarma zamanı noktaları gibi birçok tabak, Şekil gösterdi. 2.
4. Isı şoku
- Isı çarpması için, önceden ılık serum içeren bir su banyosunda 37 ° orta ˚ C
- 20 mM nihai konsantrasyonu 20 mg / ml ve MOPS serum içeren orta Siklohekzimidsiz içinde seyreltilmesi hazırlayın 'ısı şok tampon.
- Şimdi inkübatör tabak ve orta aspire.
- 'Isı şok tampon' her iyi 1 ml ekleyin ve 37 az 30 dakika boyunca inkübe ˚ C ve% 5 CO 2 (aynı zamanda bu tedavi referans plaka). Bu, de novo protein sentezi durur.
- Bu arada bir su banyosu anahtarı ve temperature ˚ C 45
- Inkübasyondan sonra, daha önce şeritler halinde kesilmiş plakalar Parafilm kapak mühür. Referans plaka (refolfed ateşböceği% 100) inkübatör bırakılır.
- 45 ˚ C 'de 30 dakika boyunca plakalar inkübe edin.
- Su banyosu plakaları çıkarın parafilm kaldırmak ve kurtarma izin inkübatör geri tabak koyun.
- Her zaman noktası hasat hücrelerin az ve 4 için 2000Xg ˚ C'de 1 dakika santrifüj PBS 1X yıkayın
5. Hücre parçalama ve lusiferaz tahlil
- Verimli bir hücre erimesi için, sıvı nitrojen içinde hücre pelletini dondurmak oturtun.
- Bir cam tüp çift distile su 1:05 seyreltilmiş pasif lizis tamponu 200 ul ekleyin.
- 96 plaka 30 ul hücre lizat ekleyin. Her örnek, üç nüsha olarak pipetlenir.
- Sadece olmayan şok 'referans örnek olacakBu adım, eşit transfeksiyon etkinliğini kontrol etmek için kullanılan bu yana, renilla lusiferaz aktivitesini okuyun.
- Test için çözümler hazırlayın. Luciferase çözümü için Gly-Gly tampon son konsantrasyonu 0.2 mM luciferase sulandırmak. Reaksiyon tamponu için Gly-Gly tampon 1mm son konsantrasyonu DTT ve ATP sulandırmak. Coelenterazine reaksiyon tamponu için, nihai konsantrasyonu 0.2 mcM coelenterazine tampon coelenterazine sulandırmak. Luciferase çözüm ve coelenterazine reaksiyon tamponu ışık korumalı tutun.
- Şimdi luminometreye 96-plaka yeri ve programı 'Wallac 1420 İş İstasyonu' başlatmak.
- Coelenterazine çözeltisi içeren şahin tüpe Pump1 tanıtın. Hiç ışık tüpü ile temas böylece kapağını kapatın.
- Seçeneği 'Dispenser bakım menüden seçiniz ve Pump1 işaretleyiniz.
- 'Doldur' seçeneğini seçin.
- Menüde 'plaka düzeni seçeneği düzenlemek için protokol ve sonuç keşfedin. Üzerinde protokol ve çift tıklayarak seçin. Şimdi kuyu okunacak seçin.
- 'Wallac Müdürü' geri dönün ve 'Başlat' düğmesine tıklayın. Renilla lusiferaz ve substrat coelenterazine arasındaki reaksiyon pik, 482 nm dalga boylu ışık yayar.
- Okuduktan sonra, 'Dispenser bakım gidin ve geri kalan tüm çözüm tüp serbest bırakmak için' Boş 've Pump1 seçin.
- Şimdi, su içeren bir şahin tüp tüp taşımak ve 'Flush' işaretleyiniz.
- Kızarma adımdan sonra, 'Boş' seçerek tüp boş.
- Reaksiyon tampon şahin tüp Pump1 ve luciferase şahin tüp Pump2 biri tüp yerleştirin.
- Plaka düzenini değiştirin.
- 'Di Pump1 ve Pump2' Doldur 'seçinSpenser Bakım 'menüsünden.
- Protokolü seçin ve okumaya başlayın. Firefly lusiferaz ve substrat luciferase arasındaki reaksiyon, 560 nm arasında bir zirve dalga boyuna sahip bir ışık yayar.
- Okuma sonunda Pump1 ve Pump2 Flush-Boş Boş işlemi tekrarlayın.
- Sonuçlar 'Wallac 1420 Explorer' artık mevcuttur.
- Her deneyde bir test numarası ile ilişkili, başlangıç ve bitiş tarihi kullanıcı adınızı.
- Sonuçlar artık bir Excel dosyası olarak ihraç edilebilir.
- 1: hesaplamalar için, hücreleri üç gruba ayrılır. olmayan şok referans örnekleri (% 100 ateşböceği lusiferaz refolded set); 2. şok moleküler hastabakıcı ve ısı olmadan hücreler; 3. hücrelerin moleküler şaperon ısı ve şok.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Protein refolding sistem yanlısı çalışıp çalışmadığını test etmek için bu nedenle iyileşme süresi doğrudan ilgili Perly bir tahlil, farklı zaman noktalarında hücrelerin toplanması yapılacak. Doğrudan bir korelasyon zaman / refolding yüzdesi, deney düzgün bir şekilde gerçekleştirilir ve bu nedenle bir sınırlayıcı faktör temsil olduğunu gösterir. Ancak her zaman ısı şokundan sonra refolding doyurarak bir olaydır ve bu nedenle uygun bir zaman ders analizi, herhangi bir deney başlamadan önce yapılmalıdır dikkate alınmalıdır.
Şekil 1. Deney Bakış. In vivo refolding tayininde tamamlanması 3 ila 4 gün gerektirir. Gün 1 hücreleri numaralı seribaşı ve transfekte. Ertesi gün, hücreleri daha küçük bir biçime parçalı ve 3. günde ısı şok. Bu noktada sağ hücreler hasat sonrası lusiferaz tahlil gerçekleştirmek için veya -80 ° C'de hücre pelletini kaydetmek ve bir an tahlil gerçekleştirmek mümkün
_content ">
Şekil 2. Hücre bölünmesi. Gününde 2 hücreleri 6 plaka ayrılır. Her transfeksiyon aynı plaka üzerindeki tüm transfeksiyon sahip olmak için iyi bir seyreltilmiş olacaktır. Her plaka belirli bir iyileşme süresi artı olmayan bir şok referans plaka karşılık gelir.
Şekil 3. Temsilcisi iyi bir sonuç. Refolding, A. Yüzde doğrudan ateşböceği lusiferaz aktivite ile ölçülür. Her çubuk grafik, farklı kurtarma zaman noktalarında moleküler şaperon varlığı yokluğu (siyah çubuklar) ve (kırmızı bar) refolding yüzdesini temsil eder. B. yokluğu (siyah çizgi) ve hastabakıcı varlığı (kırmızı çizgi) ve refolding arasında korelasyon. R kare değerleri arasında iyi bir korelasyon göstermektedir.
Fig.3A hücrelerin yokluğunda ısı şok (siyah çubuklar) 15, 30, 45, 60 ve 120 dakika sonra ve moleküler şaperon varlığı (kırmızı bar) toplandı bir temsilci sonuçları gösterilir. Yüzde refolded, uzamış iyileşme süresi ve moleküler şaperon transfeksiyon lusiferaz artar. Refolding ve zaman kontrolü (Şekil 3B, siyah çizgi) ve moleküler hastabakıcı-transfekte hücreler (Şekil 3B, kırmızı çizgi) arasındaki ilişki gösterilmiştir.
Şekil 4 Temsilcisi kötü bir sonuç. A. refolding, Yüzde doğrudan luciferase aktivitesi ölçülür. Her çubuk grafik, farklı kurtarma zaman noktalarında moleküler şaperon varlığı yokluğu (siyah çubuklar) ve (kırmızı bar) refolding yüzdesini temsil eder. Yokluğunda ve varlığında zaman ve refolding arasında B. Korelasyon (kırmızı lhastabakıcı ine). R kare değerleri kötü bir korelasyon göstermektedir.
Şekil 4A düzgün yapılan bir deneyin temsili bir sonuç göstermektedir. Kontrol (siyah çubuklar) ve moleküler hastabakıcı-transfekte hücreleri (kırmızı bar) her ikisi de zaman refolding protein bir artış göstermemiştir. Buna ek olarak, moleküler şaperon transfeksiyon refolding bir artışa yol açmamıştır. Bu zayıf bir korelasyon Şekil teyit edilir. Kontrolü (siyah çizgi) ve moleküler hastabakıcı-transfekte hücreler (kırmızı çizgi) için sırasıyla 0,6619 ve 0,1882 r kare değeri gösteren 4B.