Yöntem makalesi

Xpert MTB / RIF Testi ile Akciğer Tüberkülozu Tanısı

84.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/3547

⸱

9 Nisan 2012

 , 
1Institute for Infectious Diseases, University of Bern, 2MCL Laboratories Inc.

Bu makalede

Özet

Xpert MTB / RIF testi aynı anda tespiti için numune dekontaminasyon, eller serbest kullanım, on-board örnek işleme ve ultra-hassas hemi-nested PCR entegre Mycobacterium tuberculosis ve rifampisin direnci,. Test standardize ve sadece orta laboratuvar altyapı ve eğitim gerektirir.

Özet

Mycobacterium tuberculosis (MTB) nedeniyle Tüberküloz (TB) önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir: enfeksiyon dünya nüfusunun 1 üçte birine kadar etkiler ve yaklaşık iki milyon insan her yıl TB tarafından öldürülüyor yüksek kaliteli 2 Evrensel erişim. , tüm TB hastalar için hasta odaklı tedavi Stop TB Stratejisinin DSÖ'nün vurgulanıyor. 3 güvenilir ilaç direnci test sonuçlarına göre solunum yolu örneklerinde ve ilaç tedavisi ile MTB hızlı tespiti, bu stratejinin başarılı bir şekilde uygulanması için bir önkoşuldur. Ancak, dünyanın birçok alanda, TB tanısı hala duyarsız, kötü standart balgam mikroskop yöntemle gerçekleştirilir. Etkisiz TB algılama ve ilaca dirençli MTB suşların ortaya çıkması ve iletim giderek küresel TB kontrol aktivitelerinin tehlikeye. 2

Küresel ölçekte - - stand akciğer TB Etkin tanı durumu gerektirirardized, MTB kompleks ve rifampisin (RIF) gibi önemli antibiyotik direnç hem doğrudan algılama sağlayacak, kullanımı kolay ve güçlü tanılama araçları. İkinci sonuç çok ilaca dirençli MTB (MDR TB) için bir belirteç olarak hizmet verebilir ve güvenilir test sonuçları hızlı kullanılabilirliği> MDR-TB izolatların% 95. 4, 5 bildirilmiştir Sesi doğrudan hasta yönetimi çevirmek olasıdır sonuçta, her hasta tedavi ve toplumda TB bulaşma zincirini kıracak kararlar. 2

Sefeid Kullanıcı (Sunnyvale, CA, USA) Xpert MTB / RIF testi 6, 7, dikkat çekici bir şekilde yukarıda belirtilen taleplerini karşılar. It) balgam veya teksif sedimentlerde MTB karmaşık DNA tespiti 1 için bir nükleik asitlerin amplifikasyon testidir ve 2) rpoB geni RIF direnci ile ilişkili mutasyonların tespiti 8 Bu Sefeid Kullanıcı GeneXpert Dx ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır. Sistem thde entegre ve örnek işleme, nükleik asit amplifikasyon ve real-time PCR ve ters transkriptaz PCR kullanarak hedef dizilerinin tespiti otomatikleştirir. Sistem bir enstrüman oluşur, kişisel bilgisayar, barkod tarayıcı ve testleri çalışan ve sonuçları görüntülemek için önceden yüklenmiş yazılımlar. 9 Bu PCR'da tutun ve PCR işlemi ev sahipliği atılabilir Xpert MTB / RIF kartuşları tek kullanım kullanmaktadır. Kartuşları bağımsız olduğu için, örnekleri arasında çapraz kontaminasyon elimine edilir. MTB algılamak için kullanılan 6 Şu nükleik asit çoğaltma yöntemleri, karmaşık emek-yoğun, ve teknik olarak zor vardır. Xpert MTB / RIF testi bunu göze mümkün olacak şekilde, evrensel erişim noktası ayarlarını bakımı 3 TB ve ilaç direnci hem de, standart hassas ve çok özel tanı testi getirmek için bir potansiyele sahiptir. Erişimini kolaylaştırmak amacıyla, Yenilikçi Diagnostics Vakfı (BUL) anlamlı müzakere etticant fiyat indirimleri. Indirim için uygun ülkeler listesinde birlikte Şu BUL-anlaşmalı fiyatları, web üzerinde mevcuttur. 10

Protokol

Akciğer TB şüphesi olan tüm hastalarda bakteriyolojik inceleme için en az iki balgam örneği sunmaları konusunda Verem Bakım devletler için Uluslararası Standartlar Standart 2. Balgam yüksek verim sahiptir, bu zamanda toplanan olarak mümkün olduğunda, en az bir sabah erken numune alınması gerekir. 11 Xpert MTB / assay RIF olarak indüklenen ya ekspektore balgamlari hazırlanan balgam örnekleri veya teksif çökel uygulanabilmektedir . olumlu veya olumsuz aside dirençli basil (ARB) yayma 6, 12, 13 deney var olan akciğer TB klinik şüphesi olduğu hastaların gelen örnekleri ile kullanılmak üzere tasarlanmıştır: 1) anti-tüberküloz tedavisi, 2 almamış ) <7 tedavisinin gün, veya 3) Son 60 gün içinde tedavi almadım vardı. Bakteriyel DNA antimikrobiyal tedavi sonrası devam, çünkü ilaç tedavisi 7 etkilerinin izlenmesi için kullanılmaması gerektiğini unutmayın etmeyin.

1. Ekspektore Balgam örnekleri

Not: olduğu gibi Süreç tek seferde birçok örneği gibi, GeneXpert Dx Sistem testi çalıştırmak için kullanılabilir modülleri!

  1. Ilgili örnek kimliği ile her Xpert MTB / RIF kartuş etiketleyin.
  2. Transferi 1.0 ml steril bir transferi pipet kullanarak konik, vidalı kapaklı tüpe balgam ekspektore. Alternatif olarak, tüm numune orijinal sızdırmaz balgam toplama kabı işlenebilir.
  3. Steril bir aktarım pipet kullanılarak ekspektore balgam etmek; 2.0 ml Xpert MTB / RIF Örnek Reaktif (v / v 02:01) eklenir.
  4. Kapağı değiştirin ve gayretle 10 tüp sallayın-20 Kez. Alternatif olarak, karışımın (30 sn) santrifüja edilebilir.
  5. Tüp oda sıcaklığında 5 dakika boyunca dik bekletin.
  6. Şiddetle 10-20 kat tüpü çalkalayın. Alternatif olarak, (30 sn) bir girdap kullanın.
  7. Tüp oda sıcaklığında bir 10 dakika dik bekletin.
  8. Örnekleri inceleyin: Numune balgam hiçbir görünür kümeleri ile sıvılaştırılmış edilmelidir.

2. Konsantre Sedimanlar

Not: Süreç sadece GeneXpert Dx Sistemi olduğu gibi aynı anda çok sayıda numune olarak testleri çalıştırmak için kullanılabilir modülleri!

  1. Ilgili örnek kimliği ile her Xpert MTB / RIF kartuş etiketleyin.
  2. Steril bir aktarım pipet kullanarak konik, vidalı kapaklı tüpe 1,5 ml Xpert MTB / RIF Örnek Reaktif aktarın.
  3. Steril bir pipet kullanarak transferi Örnek Reaktif içeren tüp için en az 0.5 ml konsantre sediment ekleyin.
  4. Kapağı değiştirin ve tüp v sallayınigorously 10-20 kat. Alternatif olarak, (30 sn) bir girdap kullanın.
  5. Tüp oda sıcaklığında 5 dakika boyunca dik bekletin.
  6. Şiddetle 10-20 kat tüpü çalkalayın. Alternatif olarak, (30 sn) bir girdap kullanın.
  7. Tüp oda sıcaklığında bir 10 dakika dik bekletin.
  8. Örnekleri inceleyin: Numune balgam hiçbir görünür kümeleri ile sıvılaştırılmış edilmelidir.

3. Xpert MTB / RIF Kartuş Yükleme

Not: Kartuş için örnek ekleyerek 30 dakika içinde test başlayın!

  1. Xpert MTB / RIF kartuş ve numune ID etiketlerini kontrol edin.
  2. Kartuş kapağını açın.
  3. Sağlanan steril transferi pipet kullanarak, menisküs asgari işaretinin üstüne kadar transferi pipet içine sıvılaştırılmış örnek aspire ve Xpert MTB / RIF kartuş açık portuna örnek aktarmak.

Not:Aerosol oluşumu riski en aza indirmek için yavaş yavaş dağılır!

  1. Kartuş kapağını kapatın.

4. Test Başlangıç

Not: Teste başlamadan önce, GeneXpert Dx Sistemi GX2.1 yazılımı ile donatılmış olduğundan emin olun ve Xpert MTB / RIF testi yazılımı alınır 9!

  1. Bilgisayarınızı açın ve sonra GeneXpert Dx enstrüman açın.
  2. Windows masaüstünde, GeneXpert Dx kısayol simgesine çift tıklayın.
  3. Kullanıcı adı ve şifrenizi kullanarak GeneXpert Dx Sistemi yazılımı oturum açın.
  4. GeneXpert Dx Sistem penceresinde, test Oluştur'u tıklatın. Tarama Kartuş Barkod iletişim kutusu görüntülenir.
  5. Örnek kimlik kutusuna tarama veya örnek kimliğini yazın.
  6. Xpert MTB / RIF kartuş üzerindeki barkodu tarayın. Oluştur Testi penceresi görüntülenir.
  7. Testi Başlat
  8. Yanıp sönen yeşil ışık ile cihaz modülü kapağını açın ve yazıcı kartuşu yükleyin.
  9. Kapağını kapatın. Testi başlar ve ışık yanıp sönmek yerine sürekli yeşil kalır. Test tamamlandığında, ışığı söner.
  10. Sistemin çalışma sonunda kapı kilidi serbest bırakana kadar bekleyin, sonra modül kapı açın ve kartuşu çıkarın.
  11. Kurumunuzun standart uygulamalara göre uygun çöp konteynerleri kullanılan kartuş atın.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Her Xpert MTB / RIF kartuş MTB kompleksi ve RIF direncinin algılama gibi hedef bakteriler, yeterli işlem için kontrol etmek ve PCR reaksiyonunda inhibitörü varlığında (ler) izlemek için bir örnek işleme kontrolü (SPC) için reaktifler içeren . Prob Check Control (PCC) PCR tüp dolum, reaktif rehidrasyon doğrularkartuşu, prob bütünlüğü ve boya kararlılık. Xpert MTB / RIF testinde 9 primerler 81 baz çifti "çekirdek" bölgesini içeren rpoB geni bir kısmını yükseltmek. Moleküler işareti olarak bilinir Beş farklı renkte Flourogenik nükleik asit hibridizasyon probları, tüm 81-bp çekirdekli sorgularız. 14 Her moleküler işaret hedef dizisi vahşi tip rpoB farklıysa bu hedefine bağlamak değil, böylece özel olarak tasarlanmıştır Bir tek nükleotid ikamesi gibi azar dizisi. Bunlar, hedeflerine, yani, yabanıl tür rpoB sekansı bağlanmıştır yalnızca moleküler işaretçileri floresansı yana deneyde, beş renklerin her birinin yokluğu ile ilişkili olan çekirdek bölgede korunmuş yabani tipteki sekansı ve mutasyonlar arasındaki ayrım RIF direnci. 6

SPC olumsuz bir örnek pozitif olmalı ve pozitif bir örnek negatif veya pozitif olabilir. TestSPC negatif test tespit değilse sonuç "geçersiz" olacaktır. PCR reaksiyonu başlamadan önce, GeneXpert Dx Sistemi boncuk rehidrasyon, reaksiyon-tüp dolum, prob bütünlüğü ve boya istikrarı izlemek için problardan floresans sinyal ölçer. Problardan floresans sinyal atanan kabul kriterlerini karşılıyorsa, PCC geçer. Ölçülen sonuçlar floresan sinyalleri ve gömülü hesaplama algoritmaları GeneXpert Dx Sistem tarafından yorumlanır ve Sonuçları penceresinde 9 görüntülenir, aşağıda belirtilmiştir:

MTB Tespit: MTB hedef DNA tespit edildiğinde; her iki denetim, SPC ve PCC, atanan kabul kriterleri karşılamaktadır. Alt Ct değerlerini DNA örneğinin daha yüksek bir başlangıç ​​konsantrasyonu temsil eder; yüksek Ct değerlerini DNA örneğinin daha düşük bir konsantrasyon temsil eder. MTB DETECTED sonuçlarında "RIF Direniş DETECTED" (Şekil 1A), ("RIF direnç saptanmamıştır"

MTB Algılanmadı: MTB hedef DNA tespit değildir; her iki denetim, SPC ve PCC, atanan kabul kriterleri (Şekil 2) buluşuyor.

Geçersiz: MTB varlığı veya yokluğu tespit edilemeyen: SPC kabul kriterlerine uymuyorsa, yani örnek düzgün işlenmedi, veya PCR inhibe edilmiştir (Şekil 3). Not: Ekstra numune ile tekrar test!

Hata: (FAIL) başarısız PCC sonuçlarından biri veya daha fazlası. MTB ve SPC Hem NO SONUÇ gösterilecek. Not: Ekstra numune ile tekrar test! PCC (PASS) geçerse, hata bir sistem bileşeni hatası neden olmaktadır.

Şekil 1: MTB hedef DNA tespit edildiğinde; her iki denetim, SPC ve PCC, atanan kabul kriterleri karşılamaktadır. Alt Ct değerleri daha yüksek bir başlangıç ​​temsilDNA örneğinin konsantrasyonu; yüksek Ct değerlerini DNA örneğinin daha düşük bir konsantrasyon temsil eder. MTB DETECTED sonuçlarında "BELİRSİZ RIF Direniş" ayrı bir satırda gösterir (Şekil 1B) "RIF Direniş DETECTED", ya da, (Şekil 1A) "RIF direnç saptanmamıştır."

Şekil 1A
. Şekil 1A MTB DETECTED; RIF Direnç 81-bp RIF rpoB geni direnç belirleyici bölgesi (RRDR) yani sadece yabani tip nükleik asit dizisi, DETECTED DEĞİL mevcuttu 6. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 1B
. Şekil 1B MTB DETECTED; RIF Direnç algılandı. Pozisyonları kapsayan, Probe B (ok) terk tamamlayın R 513-517 RpoB geni RDR. 6 örnekte, kısmi sıralama rpoB gen mutasyonu D516V tespit edildiğini ortaya koymuştur. 8 büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

Şekil 2
Şekil 2 MTB hedef DNA tespit edilmedi;.. Her iki denetim, SPC ve PCC, atanan kabul kriterlerini karşılayan büyük rakamı görmek için buraya tıklayın .

Şekil 3
Örnek düzgün işlenmiş değil çünkü, SPC kabul kriterlerine uymayan ya da PCR inhibe çünkü:. MTB Şekil 3 Geçersiz test sonucu, yani varlığı veya yokluğu tespit edilemez.3547fig3large.jpg "target =" _blank "> büyük rakamı görmek için buraya tıklayın.

Tartışma

Xpert MTB / RIF test bir tek, ekspektore balgam veya konsantre sediment ya, MTB ve RIF direncinin aynı anda saptanması için numune dekontaminasyon, eller serbest kullanım, on-board örnek işleme ve ultra-hassas hemi-nested PCR entegre , sistem kullanımı kolay. Testin tespit analitik sınır 131 CFU / ml balgam olduğu bulunmuştur. 6 Ct değerleri ve MTB hücrelerin sayısı arasında log-doğrusal bir ilişki 10 Şubat-10 Temmuz CFU / ml 'den balgam geçerlidir sunulmaktadır. Klinik MTB konsantrasyonlarda test lineer aralığındaki tüm düşmek gibi, tahlil bakteri yükünün yarı-niceliksel tahminler sağlar. 7 testi sadece orta laboratuar altyapı ve eğitim gerektirir. Tespit sınırı konvansiyonel mikroskopi göre daha düşük bir büyüklükte en az iki siparişler yatmaktadır. 6 Spesifiklik mükemmeldir. Dahası, RIF-DAYANIKLI eşzamanlı algılamat MTB ilaca dirençli TB çağında nokta-bakım test ortamında önemli bir avantajdır. 3

Klinik pulmoner TBC tanısı için test performansı üzerinde sadece sınırlı yayınlanan verilerin bugüne kadar mevcut 12;. 13 kültürüne göre şüpheli pulmoner TB hastalarının balgam MTB tespit Xpert MTB / RIF testi genel klinik duyarlılık% 97.6 oldu referans olarak. Ve 1462 hasta toplam bu beş çalışma alanlarında (; Baku, Azerbaycan;; Cape Town ve Durban, Güney Afrika Mumbai, Hindistan, Lima, Peru) yer prospektif çok merkezli çalışmanın bulguları vardı. Çalışma grubundaki kültür ile doğrulanmış TB genel test öncesi olasılığı% 50.7 idi. Duyarlılığı yayma ve kültür pozitif vakaları için% 99.8 ve smear-negatif, kültür pozitif vakalar için% 90.2 idi. Akciğer TB ile HIV pozitif hastalar arasında, MTB / RIF testinin hassasiyeti gibi% 98.4 ile karşılaştırıldığında,% 93.9 oldu. Kültür göre HIV-negatif hastaların düşük TB prevalansının bir ortamda 12, MTB tespiti için genel anlaşma% 89 idi; duyarlılığı sırasıyla, yayma negatif örnekler için yayma pozitif ve% 72 için% 98 idi ve özgüllük mükemmel oldu. 13 tedavi edilmemiş balgam testleri ve konsantre çökeller üzerinde olanlar arasında duyarlılık açısından belirgin bir fark yoktu. 12 Aynı çalışmada, MTB / RIF testte 209 211 hastada (% 99.1 duyarlılık) ve in RIF direnci tespit sıralama sonuçları dikkate alınmıştır RIF duyarlılık ile tüm 506 hastada (% 100 özgüllük). 12 Yazarlar bulgular muhtemel olduğunu öne sürerek, vaka tespiti ve RIF direnci ayrımcılık, hem de performans farklı siteler arasında benzer olduğunu bulundu yaygın olarak uygulanabilir. Ayrıca 12 gibi bronko-alveolar lavaj ve bronş gibi balgam dışında solunum yolu örneklerinde konsantre çökelleri,l salgıları, benzer duyarlılık ve özgüllük ile test edilmiştir. test performansı üzerinde 13 Veri ekstra pulmoner TBC test ortaya çıkmaktadır. 15

Küresel TB kontrolü acilen noktası bakım ayarları. MTB algılamak için kullanılan 3 Şu nükleik asit çoğaltma yöntemleri, emek-yoğun karmaşık hızlı yeni TB olgularının tanı ve evrensel erişim RIF dirençli MTB algılanmasına izin etkili araçlara ihtiyacı ve teknik olarak zor. Xpert MTB / RIF testi bunu göze mümkün olacak şartıyla, bu ayarlara TB ve ilaç direnci, her ikisi için de, standart hassas ve çok özel tanı testi getirmek için bir potansiyele sahiptir. Erişimini kolaylaştırmak amacıyla, Yenilikçi Diagnostics (BUL) Vakfı Xpert MTB / RIF testi için önemli fiyat indirimleri konusunda çalışmalar yapmaktadır. Indirim için uygun ülkeler listesinde birlikte Şu BUL-anlaşmalı fiyatları, web üzerinde mevcuttur. 10

Açıklamalar

Çıkar çatışması ilan etti.

Teşekkürler

Yazarlar dikkatle atılırlar WJ Looney kabul ediyorsunuz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktif / Ekipman Şirket Katalog numarası
Xpert MTB / RIF testi Sefeid GXMTB/RIF-10
Transferi pipetler Sarstedt 86.1172.001
Konik tüpleri, 15 mL, 120 x 17 mm, PS Sarstedt 62.553.542

Kaynaklar

  1. Sudre, P., Dam, ten, Chan, G., C,, Kochi, A. Tuberculosis in the present time: a global overview of the tuberculosis situation. World Health Organisation Document WHO/TUB/91. 158, 1-47 (1991).
  2. World Health Organisation. Global tuberculosis control: epidemiology, strategy, financing. WHO report 2010. , (2010).
  3. The global plan to stop TB, 2006-2015. , World Health Organization. Geneva. (2006).
  4. Morris, S., et al. Molecular mechanisms of multiple drug resistance in clinical isolates of Mycobacterium tuberculosis. J. Infect. Dis. 171, 954-960 (1995).
  5. Traore, H., Fissette, K., Bastian, I., Devleeschouwer, M., Portaels, F. Detection of rifampicin resistance in Mycobacterium tuberculosis isolates from diverse countries by a commercial line probe assay as aninitial indicator of multidrug resistance. Int. J. Tuberc. Lung Dis. 4, 481-484 (2000).
  6. Helb, D., et al. Rapid Detection of Mycobacterium tuberculosis and Rifampin Resistance by Use of On-Demand Near-Patient Technology. J. Clin. Microbiol. 48, 229-237 (2010).
  7. Blakemore, R., et al. Evaluation of the Analytical Performance of the Xpert MTB/RIF. Assay. J. Clin. Microbiol. 48, 2495-2501 (2010).
  8. Telenti, A., et al. Detection of rifampicin-resistance in Mycobacterium tuberculosis. Lancet. 341, 647-650 (1993).
  9. GeneXpert Dx System Operator Manual. , Cepheid Inc. Sunnyvale, CA, USA. (2011).
  10. Foundation for new innovative diagnostics [Internet]. , Geneva, Switzerland. Available from: http://www.finddiagnostics.org/about/what_we_do/successes/find-negotiated-prices/xpert_mtb_rif.html (2011).
  11. International Standards for Tuberculosis Care (ISTC). , Tuberculosis Coalition for Technical Assistance. The Hague. (2009).
  12. Boehme, C. C., et al. Rapid Molecular Detection of Tuberculosis and Rifampin Resistance. N. Engl. J. Med. 363, 1005-1015 (2010).
  13. Marlowe, E. M., et al. Evaluation of the Cepheid Xpert MTB/RIF assay for the Direct Detection of Mycobacterium tuberculosis Complex from Respiratory Specimens. J. Clin. Microbiol. 49, 1621-1623 (2011).
  14. El-Hajj, H. H., Marras, S. A. M., Tyagi, S., Kramer, F. R., Alland, D. Detection of rifampin resistance in Mycobacterium tuberculosis in a single tube with molecular beacons. J. Clin. Microbiol. 39, 4131-4137 (2001).
  15. Hillemann, D., Ruesch-Gerdes, S., Boehme, C., Richter, E. Rapid molecular detection of extrapulmonary tuberculosis by automated GeneXpert MTB/RIF system. J. Clin. Microbiol. 49, 1202-1205 (2011).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Xpert MTB RIF AnaliziT berk loz Tan sRifampisin Direnci TespitiGeneXpert Dx SistemiBalgam rne i lemeGer ek Zamanl PCRN kleik Asit AmplifikasyonuMycobacterium tuberculosisla Direnci TestiBak m Noktas Testi

İlgili makaleler