13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13 C-etiketleme
Bu makalede
Özet
Özet
Mikroplar, biyokimya ve işlevsel genomik yöntemleri kullanılarak araştırılmalıdır karmaşık metabolik yollar var. Hücre merkezi metabolizma incelemek ve yeni enzimler keşfetmek için önemli bir teknik, 13 C-destekli metabolizma analizi 1 . Bu teknik izotopik etiketleme, mikropların 13 C etiketli substratları ile beslenen sayede dayanmaktadır. Biyokimyasal ağ metabolitleri arasında atom geçiş yolları takip ederek, işlevsel yollar belirlemek ve yeni enzimler keşfetmek.
Transkriptomik ve proteomik, metabolik yollarının isotopomer yardımlı analizi için tamamlayıcı bir yöntem yaklaşımları üç önemli adımlar 2 içeren İlk 13 C etiketli substratlar hücreleri büyür. Bu adımda, orta ve etiketli yüzeylerin seçimi kompozisyon iki önemli faktör vardır. Besin takviyeleri etiketli karbon ölçümü gürültüleri önlemek için, Tek bir karbon kaynağı ile en az bir ortam gereklidir. Ayrıca, etiketli bir substrat seçim analiz edilen yolun açıklamak ne kadar etkili dayanmaktadır. Roman enzimler genellikle farklı reaksiyon stereokimya genel veya ara ürünler, içerdiğinden, tek başına etiketli karbon yüzeyler, roman yollar 3, 4 tespiti için düzgün etiketli olanlardan daha roman yollarının tespiti için daha bilgilendirici İkincisi, biz GC kullanarak amino asit etiketleme kalıplarını analiz -MS. Amino asitler protein bol miktarda bulunmaktadır ve dolayısıyla, biyokütle hidroliz elde edilebilir. Amino asitler, GC ayırma önce N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) derivatized olabilir. TBDMS derivatized amino asitler, MS ve parçaları farklı diziler sonucu parçalanmış olabilir. Parçalanmış ve parçalanmamış amino asitler (m / z) oranı sorumlu kitle dayanarak, merkezi metabolitlerin mümkün etiketli desen anlayamayacağımızamino asitlerin öncüleri Üçüncü olarak, biz bu yolları 2 aktif olup olmadığını onaylamak, isotopomer verilere göre, önerilen yollar 13C karbon geçişleri izlemek ve. Amino asit ölçümü izotopik etiketleme merkezi metabolizma sekiz önemli habercisi metabolitleri hakkında bilgi sağlar. Bu metabolik anahtar düğümler ilişkili merkezi yollarının fonksiyonlarını yansıtır.
Aminoasittir ile 13 C-destekli metabolizma analizi kötü karakterize mikrobiyal metabolizma 1 fonksiyonel karakterizasyonu için yaygın olarak kullanılır . Bu protokol, yeni enzimatik fonksiyonları keşfetmek için etiketli karbon substratların kullanımını göstermek için model suşu olarak Cyanothece 51.142 kullanacaktır.
Protokol
1. Hücre kültürü (Şekil 1)
- Iz elementler, tuzlar, vitaminler ve yolağı soruşturma için en iyi olan, özellikle etiketli karbon substratları ile en az orta hücreleri büyütün. Hücre kültürü için sallayarak matara veya biyoreaktörler ya kullanın. Organik besinler, maya özü gibi, amino asit etiketleme ölçümü ile engel olabilir ve bu nedenle kültür ortamı mevcut olamaz.
- UV / VIS spektrofotometre ile optimal bir dalga boyu (örneğin, Cyanothece 51.142 OD 730) kültür optik yoğunluk hücre büyümesini izleyin .
- Hücreler ilk etiketli olmayan bir ortamda yetiştirilebilir. Orta-log büyüme aşamasında hücreleri etiketli orta aşılama ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol etiketli substrat hücre GC-MS ile amino asitler beslenme ve elde edilen izotopik etiketleme desen ölçme oluşmaktadır. MS veri (m / z oranlarına) MS iyonlarının etiketleme sadece toplam miktar vermek zamandan beri, biz inceleyerek hem de parçalanmamış (E-57) + m / z oranları ve parçalanmış amino asitler, amino asitlerin isotopomer dağılımları değerlendirmek için (yani, (M-159) + (F302) +). Ayrıca, kimyasal olarak benzer bir ortamı ancak farklı etiketleme desenleri (1
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Bu çalışma, bir NSF Kariyer Grant (MCB0954016) ve DOE Biyoenerji Araştırma Bursu (DEFG0208ER64694) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktifi Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | - |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | - |
| Etiketli karbon substrat | Cambridge İzotop Laboratuvarlarında | Deneysel gereksinimi bağlıdır. | Web sitesi : http://www.isotope.com |
| Gaz kromatograf | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | - |
| GC Kolonları | J & W Scientific, Folsom, CA | DB5 (30m) | - |
| Kütle spektrometresi | Agilent Technologies | 5975C | - |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Scientific | TS-18.825 | Amino asit örnekleri kurutma için |
Kaynaklar
- Zamboni, N., Sauer, U. Novel biological insights through metabolomics and 13C-flux analysis. Curr. Opin. Microbiol. 12, 553-558 (2009).
- Tang, Y. J. Advances in analysis of microbial metabolic fluxes via 13C isotopic labeling. Mass. Spectrom. Rev
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
