Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Summary

Bu yöntem gerçek zamanlı ve bu hız, yer değiştirme ve hız gibi farklı hücre göçü parametrelerinin nicel ölçümleri hücrelerin izlenmesine olanak sağlar. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu gerçek zamanlı bir yaklaşım uç kantitatif göç ölçümlere dayalı değildir, bunun yerine izlenmesi ve sürekli farklı parametreler hesaplanarak sağlar.

Abstract

Hücre göçü embriyonik gelişme, doku onarımında, bağışıklık sistemi fonksiyonu, ve tümör invazyonu ^{1, 2} önemli dinamik bir süreçtir. Yönsel, geçiş sırasında hücreleri bir hücre dışı kemotaktik sinyaline yanıt olarak, ya da bazik motilitesi makine tarafından sağlanan intrinsik kuyrukları ³ yanıt olarak hızlı bir şekilde hareket eder. Bir hücre hücrelerin kendi yerel ortamında keşfetmek için izin, düşük içsel yönü sahip olduğunda Rastgele göç oluşur.

Hücre göçü ilk tepkisi hücre, kompleks bir süreçtir polarizasyon uğrar ve göç ² yönünde çıkıntılar uzanır. Böyle Boyden çemberinin göç deneyi olarak göç ölçmek için geleneksel yöntemleri bir bitiş noktası sonucu olarak göç ölçüm sağlayan in vitro, in kemotaksis ölçmek için kolay bir yöntemdir. Ancak, bu yaklaşım ne bireysel göç parametrelerin ölçümünü sağlar, ne de visua izin vermezhücre göçü sırasında uğradığını morfolojik değişikliklerin Harp öncesi devresi.

Time lapse mikroskopi - Burada, bize video kullanarak gerçek zamanlı olarak göç hücreleri izlemeye olanak sağlayan bir yöntem sunuyoruz. Hücre göçü ve işgali kanseri işaretlerinden olduğu için, bu yöntem in vitro kanser hücre göçü ve işgali okuyor geçerli olacaktır. Trombositlerin Rastgele göç trombosit fonksiyonu ⁴ parametrelerinden biri olarak kabul edilmiştir, dolayısıyla bu metod aynı zamanda trombosit fonksiyonlarının incelenmesinde yararlı olabilir. Bu testte, hızlı, güvenilir, tekrar üretilebilir olma avantajına sahiptir, ve hücre sayısı optimizasyonu gerektirmez. Hücrelerin fizyolojik olarak uygun koşullar muhafaza etmek amacıyla, mikroskop CO ₂ kaynağı ve sıcaklık termostat ile donatılmıştır. Hücre hareketi düzenli aralıklarla mikroskop takılan bir kamera ile fotoğraf çekerken tarafından izlenir. Hücre göçü ölçüm ortalama hız ve hesaplanabilirSlidebook yazılımı ile hesaplanır verage yer değiştirme,.

Protocol

1. Plaka hazırlanması Kollajen ile Kaplı

1. 10 ug / Opti-MEM ortam içinde ml bir nihai yoğunluğa kolajeni ile seyreltilir.
2. Adım 1 den her oyuğa ilave edilerek 1.5 ml kolajeni ile Coat 6 oyuklu plakalar,. 4, bir gece boyunca inkübe ° C.
3. Ertesi gün, 1x Fosfat ile 2 kez Salin (PBS) Tamponlanmış plaka yıkayın ve PBS saklayın.

2. 6-iyi Plate Hücre Hazırlama ve Tohum

Not: Hücre hareketi için en uygun koşulları sağlamak için sıcak bir ortam ve PBS kullanın

1. Büyümeye MDA-MB-231 (invaziv meme kanseri hücre hattı) seyrek% 10 Fetal Bovine Serum (FBS) ile Dulbec....

Discussion

Gerçek zamanlı rastgele göç testi gibi hız ve yer değiştirme gibi hücre göçü parametrelerin doğru, duyarlı, analiz sağlar. Bu yöntem, nokta ölçüm değeri sonuna kadar sınırlı değildir, dolayısıyla daha nicel olduğunu. Bu yana, hücreler serumu ile normal bir DMEM ortam izlenir; serum boş ortam içinde uzun inkübasyon zararlı etkilerini azaltır. Bu, hücre göçü biçimlendirme ve böylece, bu yöntem, migrasyon farklı sübstrat etkisini araştırmak için kullanılan olabilir alt tabaka ⁸ ile temas hücre kopma bağlı olduğu.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	İkizler Bio-Ürünler	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Kollajen	BD	354231
Canlı Hücre odası & Otomatik XY kontrolörü ile Mikroskop	Olympus	Olympus 1X81
Çevre kontrol odası	Neue	Neue Canlı Hücre Odası	Bizimki odasının üstü ile uygun optikler için özel inşa edilmiş dikdörtgen cam levha üst vardır. Dikdörtgen şeklindeki bizim deneysel bir çok kullanılan çok oyuklu plakalar barındırırts.
Otomatik XY	Önce	Önce ProScan	Bu kesin dönüş time lapse mikroskopi sırasında seçilen XY pozisyonu çarpma sağlar.
Kamera		Hamamatsu EM kamera C9100
Yazılım	Genellikle, bu tür Olympus gibi mikroskop satıcı aracılığıyla satın	Slayt Kitabı 5