Model organizma C. elegans Pasif bir dolaşım sistemi olarak pseudocoelomic sıvısı kullanır. Bu sıvı Doğrudan testi daha önce mümkün olmamıştır. Burada doğrudan tahlil ekstrasellüler boşluğa bir roman tekniği sunmak ve ilke örnek bir kanıtı olarak RNAi yanıtı sırasında sistemik susturulması sinyalleri kullanır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dan Ekstrasellüler Akışkan Vampiric İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Genetik uysal model organizma C. elegans büyüme ve küçük boyutu kolaylığı, kısa döl süresi olarak etkin, biyolojik soruları sayısız içgörüler sağladı. Bu küçük boyutlu olsa da, diğer model sistemlerde bulunan teknik yaklaşımlar bir dizi izin vermemesi. Örneğin, memeli sistemlerinde ve bitkilerde aşılama teknikleri, kan transfüzyonları dolaşım sistemi bileşimi ve sinyalizasyon sorular sorarak etkinleştirdiğinizde. Son zamanlarda doğrudan test edilmesi imkansız kadar solucanın dolaşım sistemi, pseudocoelom vardır. Hücrelerarası sinyalizasyon ve dolaşım sistemi kompozisyon C. soruları cevaplamak için elegans araştırmacılar geleneksel genetik analiz, hücre / doku spesifik kurtarma ve mozaik analizi döndü. Bu teknikler hücreler arasında ne olup bittiğini anlaması için bir araç sağlar, ancak ekstrasellüler moleküllerin tanımlanması ve karakterizasyonu evrensel olarak geçerli değildir. Burada biz ne sunuyoruzdoğrudan tahlil C. pseudocoelomic sıvı WLY geliştirilmiş tekniği elegans. Tekniği ekstraselüler sıvı hacmini artırmak için genetik veya fiziksel manipülasyon ile başlar. Daha sonra hayvanların ince bir denge basıncı kontrolü sağlayan bir mikroenjeksiyon kulesi kullanarak bir vampir ters mikroenjeksiyon tekniği tabi tutulur. Ekstrasellüler sıvı izolasyonundan sonra, toplanan sıvı diğer hayvanların içine transferi ile ya da moleküler araçlar ile tayin edilebilir. Bu tekniğin etkinliğini göstermek için bir sistemik RNAi yanıtı sırasında tahlil ekstraselüler sinyal molekülleri, uzun dsRNA belirli bir örnek için ayrıntılı bir yaklaşım sunmak. Sistemik RNAi karakterizasyonu prensibi örnek bir kanıtı olsa da, biz dolaşım sistemi bileşimi ve sinyalizasyon soruları çeşitli cevaplamak için adapte olarak bu tekniği görmek.
Protokol
1. Malzemelerinin Hazırlanması
Vampirimsi ters Mikroenjeksiyon için gerekli malzeme transgenik C'ye yapmak için kullanılan standart mikroenjeksiyon teknikleri için gereken ile benzerdir elegans suşlar 1. Bazı reaktifler (ör. test plakaları) deneysel transfer günü yapılmasına rağmen, malzemelerin çok koordineli bir 8 gün süresi (zaman tablo için bakınız Tablo 1) fazla hazırlıklı olmalıdır. Bunun gibi, (gerekli reaktifler ve ekipman için Tablo 2'ye bakınız) bu tekniği kullanırken dikkatli önceden plan yapmak önemlidir.
Enjeksiyon pedleri:
<....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Biz burada model organizma C'den ekstrasellüler sıvı izolasyonu ve karakterizasyonu sağlayan yeni bir yöntem sundu elegans. Tekniği ekstrasellüler sıvı toplam hacmi artırmak için donör solucanlar genetik veya fiziksel manipülasyon ile başlar. Hücre dışı sıvı daha sonra bir modifiye mikroenjeksiyon tekniği kullanılarak izole edilir. Solucanlar işlem sırasında halen solucanlar tutmak için kuru agaroz pedleri kullanarak mikroenjeksiyon için monte edilmiştir. Pad fiziksel eki hidrostatik yerde solucan .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Biz Hunter laboratuar işbirlikçi doğasını kabul etmek ister ve bu tekniğin geliştirilmesi mümkün ve eğlenceli hale faydalı tartışma ve yardım için kendilerine teşekkür ederim. Biz Nigel Delaney ve solucan ve bakteriyel suşları için Caenorhabditis Genetik Merkezi teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri CPH GM089795 hibe ile desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
Streak + Carb
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Gün Solucan Hazırlık Malzeme Hazırlık | |||
| -7 Veya öncesinde | Temiz tutun, iyi beslenen Clr-1 (e1745) Ve N2 solucanlar | Enjeksiyon yastıkları, NGM plakalar, NGM + Carb / IPTG plakaları, OP50 LB stok Yap | |
| -6 | |||
| -5 | RNAi gıda ile gecede 3 mL inoküle | ||
| -4 | RNAi plaka embriyolar Taşı | Tohum RNAi plakası | |
| -3 | |||
| -2 | |||
| -1 | |||
| 0 | 4 saat boyunca 25 ila solucanlar Shift | Tahlil plakaları olun | |
| NGM plakalar temizlemek için solucanlar Taşı | |||
| Vampiric transferi | |||
| Alıcı Kurtar | |||
| +1 | Transferi Alıcı kaldır | ||
| +2 | Puan Döl |
Tablo 1. Malzeme hazırlama zaman çizelgesi.
Kaynak (Ahringer Besleme Library)| Ekipman Şirket Katalog numarası | ||
|---|---|---|
| Pikolitrelik Basınç Enjektör | Warner Aletleri | 65-0001 (PLI-100) |
| Flaming / Brown mikropipet Çektirme | Sutter Aletleri | P97 |
| Axiovert 200 | Zeiss | |
| Reaktifler | ||
| Madeni Yağ | EM Bilim | MX1560-1 |
| 22x50 no 1 ½ Kapak Cam | Corning | |
| SeaKem LE Agaroz | Lonza | 50004 |
| Borosilikat Cam Kapilerde | Dünya Precision Instruments | 1B100F-4 |
| Sodyum hipoklorit solüsyonu (% 5 mevcut Klor) | JT Baker | 9416-01 |
| C. elegans Ve Bakteriyel Suşlarının | ||
| Clr-1 (e1745) II 9 | Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) | CB3241 |
| GLP-1 RNAi vektör 10 | F02A9.6 | |
| Pal-1 RNAi vektör 11 | PHC187 | |
| OP50-GFP 5 | Caenorhabditis Genetik Merkezi (CGC) | OP50-GFP |
| YFP E. coli 4 | MC4100-YFP |
Tablo 2. Özel reaktifleri ve ekipmanlar.
Kaynaklar
- Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833-e833 (2008).
- Hirose, T., Nakano, Y., Nagamatsu, Y., Misumi, T., Ohta, H., Ohshima, Y. Cyclic GMP-dependent protein kinase EGL-4 con....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
