Tarafından geliştirilmesi Fare İç Kulak için Gen Transferi In Vivo Elektroporasyon

1. Ventral Laparotomi

1. Sodyum pentobarbital anestezik solüsyonu (gram vücut ağırlığı başına 7.5 uL) intraperitoneal enjeksiyonu ile; olan embriyoların embriyonik günde 11.5 (vajinal fiş algılandığında gün öğleden embriyonik gelişimin günlük 0.5 E11.5) altındadır baraj uyutmak. Anestezik solüsyonu Çalışma; mutlak etanol, 100 uL, 65 mg / mL sulu magnezyum sülfat (uterin tonu modüle) arasında 320 uL, 50 mg / mL sodyum pentobarbital çözeltisinin 180 uL ve propilen glikol 400 uL (sahip araç karışabilir sulu ve organik bileşenleri).
2. Ağrılı uyaranlara testleri yapılarak anestezi bütünlüğü değerlendirin: pençe sıkmak; kuyruk tutam, yanak ve burun kılı dokunma ve göz kırpma yanıtı. Kornealara steril oftalmik merhem uygulayın.
3. Suprapubik bölgeden makası ile göğüs kafesi ve ince bir bıçak (Oster # 40 bıçak) için karın kürk Tıraş. % 70 etanol ile karın,% 10 povidon iyot (Betadine), bir dezenfektend% 70 etanol, sırayla. Yer steril bir örtü üzerine fare karın tarafı aşağı ve sonra 2-5 dakika için bir ısıtma yastığı veya sıcak plaka (37 ° C) ayarlanır.
4. Top uçlu makasla ventral orta hat karın cildi sarın. 10-14 mm kesi uzatın. Linea alba, karın duvarının ventral orta hat boyunca bir avasküler, beyaz bağ dokusu bandı tanımlayın. Top uçlu makas ile linea alba kesilirken ve kesi 10-14 mm uzatmak. Hemen önceden ısıtılmış (37 ° C) Laktatlı Ringer solüsyonu ile karın sulanması.
5. Implantasyon sitelerde aşırı basınç uygulamadan halka forseps ile rahmin iki boynuzu yansıtmak. Ön ısıtması, Laktatlı Ringer solüsyonu ile dış kaynaklardan laparotomi sulayın.

2. Transuterine Mikroenjeksiyon

1. 12-16 μ: aşağıdaki özelliklere sahip bir kalın duvarlı, borosilikat cam kapiller mikroenjeksiyon pipeti fabricatem dış çapı ve 20 derece eğimli. ; Basıncı = 200; hız = 46;; = 0 çekin zamanı = 100) ısı = rampa testi artı 3 ünite: küçük kutu filamanlı bir Sutter P-97 pipet çektirmenin, aşağıdaki programı kullanın. Sutter BV-10 beveler ile, geniş çaplı pipetler için 104C (altın) aşındırıcı disk kullanın. Kalsiyum fosfat 3-4 mikrogram / uL de plazmid Pastör pipetiyle ifade (pH 7,2-7,4) tamponlu tuz. 30 saniye boyunca yavaşça konsantre DNA, vortex ile kristal hızlı yeşil ekleyin ve 10 saniye boyunca 10.000 g dönerler. Görsel enjeksiyonunun etkinliğini izlemek için gerekli hızlı yeşil minimum tutar ampirik olarak belirlenir. DNA / hızlı yeşil çözümü ile eğimli pipet dolgu. Basınçlı enjektör (Picospritzer kaynak gazı olarak>% 99 saf azot kullanarak) pipet sahibine yüklü mikroenjeksiyon pipeti bağlayın.
2. Düşük yoğunluklu, kendi implantasyon site içinde embriyo görselleştirmek için halojen ışık ile rahim Transillüminasyonda. Bea tanımlayınting kalp, beyin veziküller, bacak tomurcukları, arka beyin arasında doğmakta olan ^4. ventrikül ve göz. Ön ısıtması ile her 2 dakika, hidrasyon korumak için Ringer çözeltisi laktatlı rahim sulayın. Embriyo yönlendirme ve anatomik yukarıda belirtildiği tanımlamak için rahim üzerinde hafif basınç uygulayın.
3. Orient embriyo anterior ve posterior dalları kanadını otocyst bulunduğu mezenkimal toprakları birincil baş damarı tespit etmek. Uygun otocyst rahim transillüminasyon tarafından görülemez. Otocyst damarın ana gövde ile birlikte, bir Amerikan futbol sahası üzerinde dikey veya goalposts şekli oluşturan, primer baş venin anterior ve posterior dalları arasındaki ortasında bulunur. Otocyst sabitlenmesini ortasındadır.
4. Otocyst ve olası konumu ile uyumlu bir yörünge içinde rahim yoluyla enjeksiyon pipeti yerleştirin. Uter geçtikten sonra bir kez mikroenjektör darbeliBizim izleyici boya ve pipet yaklaşık konumunu görselleştirmek için. Mikrometre kontrol altında pipet Advance ve derinlik değerlendirmek için tekrar darbe. Ayrıca sürekli yanal baş mezenşim ve nabız içine pipet ilerlemek. Başarılı otocyst hedefleme dorsale endolenfatik kanal ve tarak Vestibül kabuk şekli konik şekli ortaya çıkaracaktır. Rahim üzerinde baskı bırakın, tek hareketle embriyo / uterustan pipet çıkarın ve hemen ısıtması ile rahim sulanması, Ringer çözeltisi laktatlı.

3. Vivo olarak Elektroporasyon

1. Laktatlı Ringer solüsyonu ile rahim sulayın. Taze uygulanmış laktatlı Ringer çözeltisi elektriksel çift kürek tarzı elektrotlara rahim gereklidir. Laktatlı Ringer ile elektrot tungsten yüzeyleri nemlendirin. Elektrotlar yolunda Merkezi enjekte otocyst. Yavaşça elektroporasyon pa rahim sıkıştırmakddles. Katod enjekte otocyst ve anot uninjected otocyst bitişik uterus duvarı ile temas halinde olduğu lateral uterus duvar ile temas halindedir. Elektroporatörün üzerine ayak pedalı anahtarı ile bir kare dalga darbe tetikler. Elektroporasyon parametreler şunlardır: puls başına 43 volt ve 950 msn interpulse gecikme az 5, 50 ms darbe. Puls teslim hemen sonra rahim sulanması. 60-100 mAmps Otik epitel ataları transferinde yeterlidir: doku teslim mevcut kaydedin. Enjekte edilir ve baraj başına 4-6, E11.5 embriyolar electroporate.
2. Olan iç kulaklarında olan bu embriyoların ^4. ventriküle sulu floresan dekstran (Alexa Fluor 488 plazmid ifade bir yeşil floresan proteini kodlayan eğer plazmid ifade bir kırmızı floresan proteini veya Alex Fluor 594 kodlar varsa) ikinci bir bağımsız transuterine mikroenjeksiyon gerçekleştirin doğru enjekte edilir ve puls başına akımının en az 60 mAmps de olduelektroporasyon sırasında yürekli. Floresan dekstran ardbeyin doğumda tespit edilebilir ve iç kulak (3.5) embriyogenez sırasında manipüle edildi yavrularının seçimi sağlayacaktır.
3. Laktatlı Ringer ile laparotomi sulayın. Karın boşluğuna laparotomi yeniden takın. Ön ısıtması, Laktatlı Ringer çözeltisi 2-4 ml ile rahim boşluğuna boşaltır ve taşma steril örtüyü üzerine kesi dışarı akmasını sağlar. Kuru, steril malzeme ile dökümlülüğü değiştirin. Olmayan bir kesici iğne ve bir 6-0 emilebilir sütür ile karın duvarı dikin. Biz karın duvarı hem de deri için, her dikiş kilitleme, çalışan bir dikiş tercih.
4. Barajlar 'kürk kurulayın ve deri altı enjeksiyon yoluyla bir non-steroid anti-inflamatuar gibi Meloksikam gibi yönetmek. Steril bir örtü üzerinde önceden ısıtılmış kurtarma kafesine baraj dönün. Monitör ve kanlı akıntı için barajlar 'solunumda, yara yeri açıklığı ve vajina kaydedin. Kanama ra olduğunuyeniden ama mevcut ve hız kesmeden eğer o anestezi altında iken, baraj euthanize. O bilinç ve ambulasyon girişimleri kavuşur zaman unutmayın. O yeme ve içme belirtileri gösterir ve yuva inşa etmeye başlamıştır fare koloniye baraj dönün. Genellikle, bu 12 saat içinde gerçekleşir.
5. Doğumda (postnatal gün 0), flaş bir GFP veya Texas Red filtresi ile stereofluorescence mikroskop kullanarak floresan dekstran algılamak için çöp her yavru ile arka beyin bölgesi uygun şekilde ayarlayın. Sadece emziren baraj ardbeyin etiketleme gösterilecek bu yavrulardan dönün.

4. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1.. Gelişmekte cochlea'ya Elektroporasyon aracılı gen transferi. E11.5 otocyst (darbe tra bir ifade plazmid kodlama gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) ve electroporated ile enjekte edildiparametreler: Beş, 50 msn / nabız ve 950 msn interpulse gecikme) az 43 volt bakliyat. Otocyst koklea ortasında açmak yoluyla tabanından EGFP ifade gösteren E11.5 enjekte edildi ve electroporated yavru postnatal günde 6 (P6) A) bir temsilci iç kulak. Koklea lateral duvarında orta dönüş ve apeks sadece çıkarıldı. Apeks doğuran E11.5 ataları transfekte değildi. B) koklea İmmünoboyama Tüm mount (A) saç hücre belirteci ile, miyozin 7a (Myo7a), bu EGFP ifade Corti organı yörüngesini takip eder ve fena halde saç hücresi taşıyan duyusal epitel yerleştiğini gösterir. Otocyst E11.5 enjekte edildi ve electroporated bir E18.5 embriyo C) bir temsilci iç kulak. Lazer konfokal projeksiyon Myo7a pozitif duyusal kıl hücrelerinin EGFP ifade gösterir. EGFP expressio belirten Corti E18.5 organ koklear duyu epiteli D) Lazer konfokal projeksiyonn iç saç hücrelerinde (IHC), dıştaki saç hücreleri (OHC), iç falankslarında hücreleri (IPC), ayak hücreleri (PC), ve Deiters 'hücreleri (dc). (B) 'de ölçekli çubuğu (A) için de geçerlidir.

Çıkar çatışması ilan etti.