İnsan papillomaviri gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlerin T-hücresi epitoplarının karakterizasyonu, dolaşımdaki T hücresi sayısının sınırlı olması nedeniyle zorludur. Nadir T hücrelerinin, çok az sayıdaki hücreden başlanarak izole edildiği ve karakterize edildiği bir yöntem açıklanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan papilloma virüsü (HPV) gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlere özgü nadir T hücrelerinin izole edilmesi ve karakterize edilmesindeki zorlukların üstesinden gelmek için bir protokol geliştirilmiştir. İşlem basamakları; bir denekten T hücresi epitopu (epitopları) içeren HPV protein bölgelerinin belirlenmesi, interferon-γ (IFN-γ) sekresyonuna dayalı olarak peptit spesifik T hücrelerinin seçilmesi ve T hücresi klonlarının büyütülüp karakterize edilmesi şeklindedir (Şekil 1). Denek 1, yakın zamanda biyopsi ile yüksek dereceli skuamöz intraepitelyal lezyon tanısı konmuş ve T hücrelerinin toplandığı gün tedavi amacıyla loop elektriksel eksizyon prosedürüne tabi tutulmuş bir hastadır1. Örtüşen sentetik peptitler ile gerçekleştirilen bir IFN- γ enzimle bağlantılı immünospot (ELISPOT) analizi kullanılarak, insan papilloma virüsü tip 16 (HPV 16) E6 ve E7 proteinleri içerisinde bir T hücresi epitopu içeren bir bölge belirlenmiştir (Şekil 2). Bu analizden elde edilen veriler, yalnızca bir T hücresi epitopu içeren bölgeyi belirlemek için değil, aynı zamanda epitop spesifik T hücrelerinin sayısını tahmin etmek ve ticari olarak mevcut manyetik boncuklar (CD8 T hücresi izolasyon kiti, Miltenyi Biotec, Auburn CA) kullanarak bunları IFN- γ sekresyonu temelinde izole etmek için kullanılmıştır. Seçilen IFN-γ salgılayan T hücreleri, her kuyukta tek bir T hücresinin büyümesini desteklemek amacıyla, ışınlanmış bir besleyici hücre karışımı varlığında seyreltilmiş ve tek tek büyütülmüştür. Gereken T hücresi klon hücresi sayısını minimize etmek amacıyla, bu T hücresi klonları, belirlenen bölgeyi kapsayan peptitlerin ve otolog Epstein-Barr virüsü transformasyonlu B-lenfoblastoid hücrelerin (Walls ve Crawford tarafından tarif edildiği şekilde elde edilen LCL'ler)2 varlığında bir IFN- γ ELISPOT analizi kullanılarak taranmıştır. ELISPOT analizlerinde tipik olarak kullanılan kuyuk başına 1 x 105 hücre yerine1,3, 1 x 105 otolog LCL varlığında 1.000 T hücresi klon hücresi kullanılmış, böylece ihtiyaç duyulan T hücresi klon hücresi sayısı önemli ölçüde azaltılmıştır. Otolog LCL'ler, sadece peptit antijenlerini T hücresi klon hücrelerine sunmakla kalmamış, aynı zamanda kuyuklarda yüksek bir hücre yoğunluğu sağlayarak epitop spesifik T hücresi klon hücrelerinin IFN-γ salgılamasına olanak tanımıştır. Bu durum, IFN-γ ELISPOT analizinin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlar. Benzer şekilde, CD8 T hücresi epitopunun (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) minimal ve optimal amino asit dizisini ve HLA sınıf I kısıtlama elementini (B58) karakterize etmek için IFN- γ ELISPOT analizleri kullanılmıştır. IFN- γ ELISPOT analizi ayrıca, HPV 16 E6 veya E7 proteinini eksprese eden vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş otolog LCL'ler kullanılarak da gerçekleştirilmiştir. Sonuç, E6 T hücresi epitopunun endojen olarak işlendiğini göstermiştir. Diğer yüksek riskli HPV tiplerinin homolog T hücresi epitoplarının çapraz tanınması gösterilmiştir. Bu yöntem CD4 T hücresi epitoplarını tanımlamak için de kullanılabilir4.
Protokol
Denek 1'den oluşturulan bir CD8 T hücresi hattı ile IFN-γ ELISPOT analizi yapılarak, HPV 16 E6 46-70 bölgesinin bir T-hücresi epitopu içerdiği belirlenmiş1 (Şekil 2>) ve bu protokole başlanmadan önce epitopa özgü T hücreleri, IFN-γ salınımına göre seçilmiştir (Şekil 1).
1. Epitop Spesifik T Hücrelerinin Limit Dilüsyonu
- Işınlanmış (4,000 rad) allojenik periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC) 5 x 105 hücre/ml, ışınlanmış (5,000 rad) allojenik LCL'leri 5 x 104 hücre/ml ve fitohemaglutinin (PHA)'i 0,1 μg/ml konsantrasyonlarda, %1 havuzlanmış insan serumu içeren ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Geleneksel olarak immünologlar, ilgili T hücrelerini in vitro stimüle ederek ve epitopa özgü T hücre klonlarını izole etmek için sınırlayıcı dilüsyon deneyi gerçekleştirerek yeni T hücresi epitoplarını karakterize etmeye çalışmışlardır. Ardından, T hücresi klonları bir kromyum salınım analizi kullanılarak karakterize edilmiştir 8,9. Ancak, T hücrelerinin frekanslarının izole edilemeyecek kadar düşük olması veya karakterizasyonu tamamlamak için yeterli sayıda T hücresi klon hücresinin bulunmaması neden.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, bir Amerikan Kanser Cemiyeti Akademisyen Ödülü (RSG-06-180-01-MBC) ve NIH hibeleri (R01 CA143130 ve UL1RR029884) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| CD8 T hücresi izolasyon kiti | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Fitohemaglutinin | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2mg/flakon |
| Yssel’ besiyeri | Gemini Bio Products | 400-102 | %1 havuzlanmış insan serumu |
| 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plaka | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| Rekombinan insan IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| 24 kuyucuklu plaka | Corning | 07-200-84 | |
| Fosfat tamponlu salin | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| Primer anti-IFN-γ monoklonal antikor (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| Biotin konjuge anti-IFN-γ monoklonal antikor (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| Multiscreen HA ELISPOT plakası | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| Dimetil sülfoksit | Sigma-Aldrich | D2650 | 100 ml şişe |
| Havuzlanmış serum, insan | Atlanta Biologicals | S40510H | Isıyla inaktive edilmiş |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| Vectastain Elite ABC Kiti | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| Stabil diaminobenzidin | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
Kaynaklar
- Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
- Walls, E., Crawford, L.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
