İnsan papillomaviri gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlerin T-hücresi epitoplarının karakterizasyonu, dolaşımdaki T hücresi sayısının sınırlı olması nedeniyle zorludur. Nadir T hücrelerinin, çok az sayıdaki hücreden başlanarak izole edildiği ve karakterize edildiği bir yöntem açıklanmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Human Papillomavirüs Roman T hücre epitopları Karakterizasyonu için interferon-γ Enzim bağlı immünospot Assay Kullanımı
Bu makalede
Özet
Özet
İnsan papilloma virüsü (HPV) gibi lokalize enfeksiyonlara neden olan patojenlere özgü nadir T hücrelerinin izole edilmesi ve karakterize edilmesindeki zorlukların üstesinden gelmek için bir protokol geliştirilmiştir. İşlem basamakları; bir denekten T hücresi epitopu (epitopları) içeren HPV protein bölgelerinin belirlenmesi, interferon-γ (IFN-γ) sekresyonuna dayalı olarak peptit spesifik T hücrelerinin seçilmesi ve T hücresi klonlarının büyütülüp karakterize edilmesi şeklindedir (Şekil 1). Denek 1, yakın zamanda biyopsi ile yüksek dereceli skuamöz intraepitelyal lezyon tanısı konmuş ve T hücrelerinin toplandığı gün tedavi amacıyla loop elektriksel eksizyon prosedürüne tabi tutulmuş bir hastadır1. Örtüşen sentetik peptitler ile gerçekleştirilen bir IFN- γ enzimle bağlantılı immünospot (ELISPOT) analizi kullanılarak, insan papilloma virüsü tip 16 (HPV 16) E6 ve E7 proteinleri içerisinde bir T hücresi epitopu içeren bir bölge belirlenmiştir (Şekil 2). Bu analizden elde edilen veriler, yalnızca bir T hücresi epitopu içeren bölgeyi belirlemek için değil, aynı zamanda epitop spesifik T hücrelerinin sayısını tahmin etmek ve ticari olarak mevcut manyetik boncuklar (CD8 T hücresi izolasyon kiti, Miltenyi Biotec, Auburn CA) kullanarak bunları IFN- γ sekresyonu temelinde izole etmek için kullanılmıştır. Seçilen IFN-γ salgılayan T hücreleri, her kuyukta tek bir T hücresinin büyümesini desteklemek amacıyla, ışınlanmış bir besleyici hücre karışımı varlığında seyreltilmiş ve tek tek büyütülmüştür. Gereken T hücresi klon hücresi sayısını minimize etmek amacıyla, bu T hücresi klonları, belirlenen bölgeyi kapsayan peptitlerin ve otolog Epstein-Barr virüsü transformasyonlu B-lenfoblastoid hücrelerin (Walls ve Crawford tarafından tarif edildiği şekilde elde edilen LCL'ler)2 varlığında bir IFN- γ ELISPOT analizi kullanılarak taranmıştır. ELISPOT analizlerinde tipik olarak kullanılan kuyuk başına 1 x 105 hücre yerine1,3, 1 x 105 otolog LCL varlığında 1.000 T hücresi klon hücresi kullanılmış, böylece ihtiyaç duyulan T hücresi klon hücresi sayısı önemli ölçüde azaltılmıştır. Otolog LCL'ler, sadece peptit antijenlerini T hücresi klon hücrelerine sunmakla kalmamış, aynı zamanda kuyuklarda yüksek bir hücre yoğunluğu sağlayarak epitop spesifik T hücresi klon hücrelerinin IFN-γ salgılamasına olanak tanımıştır. Bu durum, IFN-γ ELISPOT analizinin başarılı bir şekilde gerçekleştirilmesini sağlar. Benzer şekilde, CD8 T hücresi epitopunun (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) minimal ve optimal amino asit dizisini ve HLA sınıf I kısıtlama elementini (B58) karakterize etmek için IFN- γ ELISPOT analizleri kullanılmıştır. IFN- γ ELISPOT analizi ayrıca, HPV 16 E6 veya E7 proteinini eksprese eden vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş otolog LCL'ler kullanılarak da gerçekleştirilmiştir. Sonuç, E6 T hücresi epitopunun endojen olarak işlendiğini göstermiştir. Diğer yüksek riskli HPV tiplerinin homolog T hücresi epitoplarının çapraz tanınması gösterilmiştir. Bu yöntem CD4 T hücresi epitoplarını tanımlamak için de kullanılabilir4.
Protokol
Denek 1'den oluşturulan bir CD8 T hücresi hattı ile IFN-γ ELISPOT analizi yapılarak, HPV 16 E6 46-70 bölgesinin bir T-hücresi epitopu içerdiği belirlenmiş1 (Şekil 2>) ve bu protokole başlanmadan önce epitopa özgü T hücreleri, IFN-γ salınımına göre seçilmiştir (Şekil 1).
1. Epitop Spesifik T Hücrelerinin Limit Dilüsyonu
- Işınlanmış (4,000 rad) allojenik periferik kan mononükleer hücrelerini (PBMC) 5 x 105 hücre/ml, ışınlanmış (5,000 rad) allojenik LCL'leri 5 x 104 hücre/ml ve fitohemaglutinin (PHA)'i 0,1 μg/ml konsantrasyonlarda, %1 havuzlanmış insan serumu içeren tamamlanmış Yssel besiyeri kullanarak birleştirip besleyici hücre karışımını hazırlayın. Hücreler, protokol boyunca steril koşullar altında işlenmelidir.
- İzole edilmiş epitop spesifik T-hücrelerini (Şekil 3), konsantrasyon 0,5 hücre/100 μl veya 5 hücre/1 ml'ye ulaşana kadar besleyici hücre karışımını kullanarak seri dilüsyonla seyreltin. Yaklaşık 3 x 103 epitop spesifik T-hücresi kullanın.
- Seyreltilmiş epitop spesifik T-hücrelerinden kuyu başına 100 μl'yi, çok kanallı bir pipet kullanarak toplam 30 ila 60 adet 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plakaya ekleyin.
- Plakaları 37 °C ve %5 CO2 içeren bir inkübatörde inkübe edin.
- 5. Günde, 20 u/ml rekombinant insan interlökin-2 (rhIL-2) içeren 100 μl tamamlanmış Yssel besiyeri ekleyin.
- 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plakalardaki büyüyen T-hücre klonlarını, tabandaki büyük pellet boyutlarından gözle belirleyin.
- 11. ile 14. Günler arasında; ışınlanmış (4,000 rad) allojenik PBMC'leri 1 x 106 hücre/ml, ışınlanmış (5,000 rad) allojenik LCL'leri 1 x 105 hücre/ml ve PHA'yı 0,1 μg/ml konsantrasyonlarda tamamlanmış Yssel besiyeri kullanarak birleştirip yeni bir besleyici hücre karışımı hazırlayın. Bu yeni besleyici hücre karışımını 24 kuyucuklu bir plakaya kuyu başına 1 ml olacak şekilde ekleyin.
- T-hücre klonlarını, yaklaşık 200 μl hacim kapasitesine sahip bir mikropipet kullanarak her kuyucuktan tek tek aspire edin.
- T-hücre klonlarını, yeni besleyici hücre karışımını içeren 24 kuyucuklu plakaya tek tek dağıtın. Tüm T-hücre klonları transfer edilene kadar işlemi tekrarlayın.
2. Yüksek Kapasiteli Tarama ELISPOT Analizi Kullanarak Epitop Spesifik T-hücre Klonlarının Tanımlanması (Larsson ve ark.5 tarafından tanımlanan bir yöntemden uyarlanmıştır)
- 2 adet steril ELISPOT plakasını (Multiscreen-HA; Millipore, Bedford, MA), steril doku kültürüye uygun fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 5 μg/ml'ye dilüe edilmiş primer anti-IFN-γ monoklonal antikorun (klon D1K, Mabtech, Stockholm, İsveç) 50 μl/kuyu'su ile 4 °C'de en az 1 saat boyunca kaplayın.
- Kuyuları, kuyu başına 150 ila 200 μl PBS ekleyip dökerek yıkayın. Bu işlemi üç kez daha tekrarlayın.
- RPMI 1640 kullanılarak %5'e dilüe edilmiş havuzlanmış insan serumundan kuyu başına 50 μl ekleyerek, 37 °C'de, %5 CO2 ortamında en az 1 saat boyunca non-spesifik bağlanmayı bloke edin. Büyük hava kabarcıklarını steril bir iğne ile patlatarak dağıtın.
- Kuyu başına 50 μl %5 insan serumlu RPMI 1640 içinde 1 x 105 otolog LCL2 ekleyin.
- T-hücresi klonlarını içeren 24 kuyucuklu plaktaki her bir kuyucuğun hücrelerini 1 ml'lik bir pipet kullanarak karıştırın. Kuyu başına 100 μl'yi steril bir Eppendorf tüpüne aktarın. Her bir Eppendorf tüpüne 500 μl %5 havuzlanmış insan serumlu RPMI 1640 ekleyin ve bir mikrosantrifüjde 3.000 RPM'de 5 dakika santrifüjleyin.
- Eppendorf tüplerini boşaltın, tüp başına 110 μl %5 insan serumlu RPMI 1640 ekleyin ve hücreleri bir vorteks yardımıyla yeniden süspande edin.
- Hızlı tarama için hücre sayılarına bakılmaksızın, belirli T-hücresi klonlarını içeren ortamdan 50 μl'yi 2 plakanın aynı konumdaki kuyularına ekleyin. Tüm T-hücresi klonları için tekrarlayın. Hücre sayım basamakları elenerek, çok sayıda T-hücresi klonu aynı anda test edilebilir.
- Birkaç Eppendorf tüpünden kalan ortamları birleştirin ve PHA eklenecek pozitif kontrol kuyuları olarak kullanılacak sonraki aynı konumdaki kuyulara 50 μl ekleyin.
- T-hücresi klonu içermeyen ve negatif kontrol kuyusu olarak hizmet edecek her bir kuyuya 50 μl %5 havuzlanmış insan serumlu RPMI 1640 ekleyin.
- Pozitif bölgede (Tablo 1) bulunan peptidleri, kuyu başına 50 μl'de 10 μM/peptid nihai konsantrasyona gelecek şekilde ekleyin. Peptid stokları, peptid çözünürlüğüne bağlı olarak PBS içinde %5 - %15 dimetil sülfoksitte her biri 5mM olarak çözülmüştür. Her kuyu toplam 200 μl hacim içerecektir (50 μl bloklama, 50 μl LCL'ler, 50 μl T-hücresi klonları ve 50 μl peptidler).
- Pozitif kontrol kuyularına 50 μl PHA (nihai konsantrasyon 10 μg/ml) ekleyin.
- Negatif kontrol kuyularına 50 μl %5 havuzlanmış insan serumlu RPMI 1640 ekleyin.
- 37 °C'de, %5 CO2 ortamında gece boyunca inkübe edin.
- Kuyuları, kuyu başına 150 ila 200 μl %0,05 Tween-20 içeren PBS ekleyip dökerek yıkayın. Bu işlemi üç kez daha tekrarlayın.
- 1 μg/ml biotin-konjuge anti-IFN-γ monoklonal antikor (klon 7B-6, Mabtech) içeren 50 μl PBS ekleyin ve 37 °C'de, %5 CO2 ortamında 2 saat inkübe edin. Büyük hava kabarcıklarını bir iğne ile patlatarak dağıtın.
- 2 saatlik inkübasyonun bitimine yirmi dakika kala, 5 ml %0,1 Tween-20 içeren PBS'ye çözelti A ve çözelti B'den 2'şer damla ekleyerek avidin bağlı biotinillenmiş horseradish peroksidaz H'yi (Vectastain Elite ABC kiti; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) hazırlayın.
- Kuyuları, kuyu başına 150 ila 200 μl %0,1 Tween-20 içeren PBS ekleyip dökerek yıkayın. Bu işlemi üç kez daha tekrarlayın.
- Kuyu başına 50 μl biotinillenmiş horseradish peroksidaz H ekleyin ve 37 °C'de, %5 CO2 ortamında 1 saat inkübe edin. Büyük hava kabarcıklarını bir iğne ile patlatarak dağıtın.
- Kuyuları, kuyu başına 150 ila 200 μl %0,1 Tween-20 içeren PBS ekleyip dökerek yıkayın. Bu işlemi üç kez daha tekrarlayın.
- Kuyu başına 50 μl stabil diaminobenzidin (DAB) adı verilen renklendirme reaktifini oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ekleyin. Büyük hava kabarcıklarını bir iğne ile patlatarak dağıtın.
- Kuyuları, kuyu başına 150 ila 200 μl deiyonize su ekleyip dökerek yıkayın. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
- Plakanın tamamen kurumasını bekleyin.
- Bir diseksiyon mikroskobu veya otomatik bir ELISPOT okuyucu (AID ELISPOT Classic Reader; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Almanya) kullanarak noktaları sayın.
3. ELISPOT Analizi Kullanarak T-Hücre Klonlarının Epitopa Özgü Doğasının Doğrulanması (Şekil 4)
- İyi büyüyen T hücresi klonlarını seçin. Her kuyucuğa 1 x 105 otolog LCL ve 1 x 103 T hücresi klon hücresi ile bölgede yer alan üç peptidin (Tablo 1) her birinden 10 μM konsantrasyonda eklenecek şekilde, yukarıda açıklandığı gibi bir ELISPOT testi gerçekleştirin. Testi dublike veya triplike olarak kurun.
4. Epitopun Endojen Olarak İşlendiğinin Belirlenmesi (Şekil 5)
- İyi büyüyen T-hücre klonlarını seçin. Yukarıda açıklandığı şekilde bir ELISPOT deneyi gerçekleştirin; ancak kuyuk başına HPV 16 E6, E7 6 eksprese eden rekombinant vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş 1 x 105 otolog LCL (deneyden önce) veya hiç enfekte edilmemiş (yabanı tip, WR suşu) (1 saat boyunca 5 enfeksiyon çokluğu ile) ve 1 x 103 T-hücre klonu hücresi ekilecektir.
5. T-hücre Epitopunun Minimal ve Optimal Sekansının Karakterizasyonu (Şekil 6a, 6b ve 6c)
- İyi büyüyen T-hücre klonlarını seçin. Kuyuk başına 1 x 105 otolog LCL ve 1 x 103 T-hücre klonu hücresinin, bölgeyi kapsayan örtüşen 9-mer peptit serisinden birinin (Tablo 1) 10 μM konsantrasyonda (Şekil 6a) eklenmesi dışında, yukarıda açıklanan şekilde bir ELISPOT analizi gerçekleştirin.
- Kuyuk başına 1 x 105 otolog LCL ve 1 x 103 T-hücre klonu hücresinin, farklı uzunluktaki peptit serisinden birinin (Tablo 1) 10 μM konsantrasyonda (Şekil 6b) eklenmesi dışında, yukarıda açıklanan şekilde bir ELISPOT analizi gerçekleştirin.
- Kuyuk başına 1 x 105 otolog LCL ve 1 x 103 T-hücre klonu hücresinin, minimum ve optimal amino asit dizisini içerme olasılığı en yüksek olan birkaç peptitle birlikte eklenmesi dışında, yukarıda açıklanan şekilde bir ELISPOT analizi gerçekleştirin. Bu peptitler 10-5 M ile 10-10 M arasındaki konsantrasyonlarda test edilecektir (Şekil 6c).
6. ELISPOT Analizi Kullanarak Restriksiyon Elementinin Belirlenmesi (Şekil 7)
- İyi büyüyen T-hücre klonlarını seçin. Yukarıda açıklandığı şekilde bir ELISPOT testi gerçekleştirin; ancak bu kez kuyu başına 1 x 103 T-hücre klon hücresi, 10 μM konsantrasyondaki minimal ve optimal peptid ile birlikte ekilecektir. Ayrıca, incelenen denekle bir veya iki HLA sınıf I molekülünü paylaşan, kuyu başına yüz bin allojenik LCL de eklenecektir.
7. Epitop Spesifik T-hücre Klonlarının Diğer Yüksek Riskli HPV Tiplerinden Gelen Homolog Amino Asit Dizilerine Karşı Çapraz Reaktivitesinin İncelenmesi (Şekil 8)
- İyi büyüyen T-hücre klonlarını seçin. Her kuyucuğa 1 x 103 T-hücre klon hücresinin, diğer yüksek riskli HPV tiplerinden homolog amino asit dizileri içeren peptitlerle (10 μM) birlikte eklenmesi dışında (Tablo 2), yukarıda açıklanan şekilde bir ELISPOT analizi gerçekleştirin. Ayrıca ilgili kuyucuklara kuyucuk başına yüz bin otolog LCL ve kısıtlayıcı HLA sınıf I moleküllerini eksprese eden allojenik LCL'ler ekleyin.
8. Temsili Sonuçlar
Burada sunulan Denek 1, biyopsi ile teşhis edilmiş yakın tarihli yüksek dereceli skuamöz intraepitelyal lezyon öyküsü olan 22 yaşında Afrikalı-Amerikalı bir kadındır. T hücrelerinin toplandığı gün, loop elektrikle eksizyon prosedürü ile tedavi edilmek üzere başvurmuştur1. CD8 T-hücre hattının ELISPOT analizi, HPV 16 E6 46-70 bölgesinin (her bölge 3 örtüşen 15-mer peptit ile test edilir) bir T-hücresi epitopu içerdiğini göstermiştir (Şekil 2). IFN-γ salınımı temelinde seçilen epitopa özgü T hücresi sayısı 1.2 x 105 idi. Seçilen hücrelerin beşte birine sınırlayıcı dilüsyon (Şekil 3) uygulandıktan sonra, 262 T-hücre klonu elde edildi. T-hücresi klonlamasına yönelik ilk girişim başarılı olduğu için seçilen geri kalan hücreler kullanılmamıştır. Bu klonların 94'ü üzerinde gerçekleştirilen yüksek kapasiteli tarama ELISPOT analizi, ELISPOT plakasında makroskobik olarak kolayca tanımlanabilen 62 tarama-pozitif klon belirlemiştir. İlk ELISPOT analizi peptide özgü T-hücre klonlarını tanımladığı için geri kalan T-hücre klonları test edilmemiştir. İyi büyüyen sekiz tarama-pozitif klon, bölgeyi kapsayan üç 15-mer peptit ile ayrı ayrı yeniden test edilmiştir (Şekil 4). T-hücre klonlarının tamamı HPV 16 E6 51-65 peptitleri ile pozitif çıkmış, 8 klondan 6'sı E6 46-60 peptidi ile pozitif çıkmış ve klonların hiçbiri E6 56-70 peptidi ile pozitif çıkmamıştır. HPV 16 E6 proteinini veya E7 proteinini eksprese eden rekombinant bir vaccinia virüsü ile enfekte edilmiş otolog LCL'ler ile yapılan testler, T-hücre klonlarının endojen olarak işlenmiş bir E6 epitopunu tanıdığını göstermiştir (Şekil 5). HPV 16 46-65 bölgesini kapsayan bir dizi örtüşen 9-mer peptit ile yapılan testler (Tablo 1), E6 53-61 peptidi ile en iyi yanıtın alındığını göstermiştir (Şekil 6a). E6 53-61 peptidini içeren iki 10-mer peptit, E6 53-61 peptidi içinde yer alan iki 8-mer peptit ve iki 10-mer peptidi içeren bir 11-mer peptit test edilmiş ve E6 52-61 (10-mer) peptidi en tutarlı şekilde minimal ve optimal sekans olarak belirlenmiştir (Şekil 6b). Bununla birlikte, E6 53-61 (9-mer) peptidi, #79 numaralı T-hücre klonu ile eşit derecede güçlü bir yanıt vermiştir. Bu T-hücre klonu, söz konusu iki peptit ile daha geniş bir konsantrasyon aralığında test edilmiş ve E6 52-61 (10-mer) peptidi, daha düşük peptit konsantrasyonlarında pozitifliği E6 53-61 (9-mer) peptidinden çok daha etkili bir şekilde korumuştur (Şekil 6c). Amaç, güçlü bir yanıt gösteren en kısa sekansı tanımlamak olduğu için daha uzun olan E6 52-62 (11-mer) peptidi test edilmemiştir. E6 52-61 (10-mer) peptidinin minimal ve optimal sekansı içerdiği belirlenmiştir.
CD8 T-hücresi epitopunun kısıtlayıcı HLA sınıf I molekülü, denekle ortak bir veya iki HLA sınıf I molekülü eksprese eden allojenik LCL'ler kullanılarak bir ELISPOT testi ile incelenebilir. Ancak, ELISPOT testinde gözlemlenen yüksek arka plan nedeniyle Denek 1 için sonuçlar belirsiz kalmıştır. Denek 1 için HLA sınıf I kısıtlayıcı molekülü, daha sonra bir kromyum salınım testi kullanılarak B58 olarak tanımlanmıştır (veriler gösterilmemiştir). Şekil 7, başka bir deneğe ait örneği göstermektedir [Wang et al. tarafından tanımlandığı üzere E6 75-83'ün (KFYSKISEY) minimal ve optimal dizisini tespit ettiği belirlenen Denek A]7. B62 ve Cw3 moleküllerini eksprese eden bir LCL ile yüksek pozitiflik görülürken, Cw3 eksprese eden bir LCL ile arka plan pozitifliği görülmektedir. Bir kromyum salınım testi, B62 molekülünün Denek A için kısıtlayıcı element olduğunu doğrulamıştır7.
HPV genomunun bazı bölgeleri iyi korunmuştur ve HPV 16 E6 52-61 bölgelerine homolog diziler, diğer 13 yüksek riskli HPV tipinde mevcuttu (Tablo 2). 13 yüksek riskli HPV tipinin 8'i için güçlü çapraz tanıma (HPV 16 E6 52-61 peptidi için leke oluşturan birimlerin >%50'si) gösterilmiştir (Şekil 8).
Şekil 1. Yeni T-hücre epitop(lar)ının karakterizasyonuna yönelik deney serisini özetleyen genel şema. Bu makale, yukarıdan üçüncü kutucuktan başlayan protokolü açıklamaktadır.
Şekil 2. T-hücresi epitopunu içeren bölge(leri) belirlemek için gerçekleştirilen bir ELISPOT analizi. Kuyu başına in vitro stimüle edilmiş yüz bin CD8 T hücresi, HPV 16 E6 ve E7 proteinlerindeki her bölgeyi kapsayan üç adet 15-mer örtüşen peptit (her biri 10 μM) ile birlikte ekilmiştir. Denek 1'den alınan bu örnek, E6 46-70 bölgesinde bir T-hücresi epitopunun varlığını göstermiştir. Sütunlar ortalamaların standart hatalarını temsil etmektedir.
Şekil 3. Epitop spesifik T hücrelerinin, kuyu başına 0.5 hücre konsantrasyonuna ulaşmak için bir besleyici hücre karışımı kullanılarak nasıl seyreltileceğini gösteren şema.
Şekil 4. Üç adet 15-mer peptidin ayrı ayrı test edilmesiyle, T-hücresi epitopu içeren alt bölgeleri belirlemek için gerçekleştirilen ELISPOT analizi. Denek 1'den alınan bu örnek, epitopun E6 46-60 ve E6 51-65 alt bölgelerinde mevcut olduğunu göstermiştir. Sütunlar ortalamaların standart hatalarını temsil etmektedir.
Şekil 5. T-hücresi epitopunun endojen olarak sunulup sunulmadığını incelemek için gerçekleştirilen bir ELISPOT analizi. Denek 1'den alınan bu örnek, T-hücresi klonlarının endojen olarak işlenmiş bir E6 epitopunu tanıdığını göstermiştir. Çubuklar, ortalamaların standart hatalarını temsil etmektedir.
Şekil 6. T-hücre epitopunun en kısa ve optimal peptit dizisini karakterize etmek için gerçekleştirilen ELISPOT analizleri. Mevcut olduğunda, süreç boyunca aynı klonlar kullanılmıştır. (a) Üst üste binen 9-mer peptitler kullanılarak gerçekleştirilen bir ELISPOT analizi. Denek 1'den alınan bu örnek, epitopun E6 53-61 alt bölgesinde bulunduğunu ortaya koymuştur. (b)Çeşitli uzunluktaki peptitler kullanılarak minimal ve optimal peptit dizisini belirlemek için gerçekleştirilen bir ELISPOT analizi. Bu örnek, en kısa ve optimal peptit dizisinin en tutarlı şekilde E6 52-61 peptit, ardından E6 53-61 peptit olduğunu ortaya koymuştur. (c)Hangi peptidin minimal ve optimal diziyi içerdiğini doğrulamak için gerçekleştirilen bir ELISPOT analizi. E6 52-61 peptidi daha düşük konsantrasyonlarda pozitifliğini korumuş ve en kısa ve optimal dizi olduğu belirlenmiştir. Çubuklar, ortalamanın standart hatalarını temsil etmektedir.
Şekil 7. Kısıtlayıcı HLA sınıf I molekülünü belirlemek için gerçekleştirilen bir ELISPOT analizi. Bu örnek, B62 molekülünün, Denek A'nın HPV 16 E6 75-83 epitopunu tanıyan CD8 T-hücre klonu için kısıtlama elementi olduğu görüşünü desteklemiştir7. Bu durum, bir kromyum salınım analizi ile doğrulanmıştır. Çubuklar, ortalamaların standart hatalarını temsil etmektedir.
Şekil 8. HPV 16 52-61 spesifik T-hücre klonlarının diğer yüksek riskli HPV tiplerindeki benzer dizilere karşı çapraz reaksiyonunu değerlendirmek için gerçekleştirilen ELISPOT analizi (Tablo 2). Denek 1'den alınan bu örnek, incelenen diğer 13 yüksek riskli HPV tipinin 8'inde anlamlı çapraz reaksiyon (>%50 HPV 16 52-61 pozitifliği ile karşılaştırıldığında) göstermiştir. Sütunlar ortalamaların standart hatalarını temsil etmektedir.
| HPV Tipi | AA Kalıntıları* | Dizilim^ |
| 16 | E6 46-60 (15) | RREVYDFAFRDLCIV |
| 16 | E6 51-65 (15) | DFAFRDLCIVYRDGN |
| 16 | E6 56-70 (15) | DLCIVYRDGNPYAVC |
| 16 | E6 52-62 (11) | FAFRDLCIVYR |
| 16 | E6 52-61 (10) | FAFRDLCIVY |
| 16 | E6 53-62 (10) | AFRDLCIVYR |
| 16 | E6 46-54 (9) | RREVYDFAF |
| 16 | E6 47-55 (9) | REVYDFAFR |
| 16 | E6 48-56 (9) | EVYDFAFRD |
| 16 | E6 49-57 (9) | VYDFAFRDL |
| 16 | E6 50-58 (9) | YDFAFRDLC |
| 16 | E6 51-59 (9) | DFAFRDLCI |
| 16 | E6 52-60 (9) | FAFRDLCIV |
| 16 | E6 53-61 (9) | AFRDLCIVY |
| 16 | E6 54-62 (9) | FRDLCIVYR |
| 16 | E6 55-63 (9) | RDLCIVYRD |
| 16 | E6 56-64 (9) | DLCIVYRDG |
| 16 | E6 57-65 (9) | LCIVYRDGN |
| 16 | E6 53-60 (8) | AFRDLCIV |
| 16 | E6 54-61 (8) | FRDLCIVY |
* Amino asit sayısı parantez içinde gösterilmiştir.
Tablo 1. Minimal ve optimal antijenik peptid dizisini belirlemek için kullanılan HPV 16 E6 peptidlerinin amino asit dizileri.
| HPV Tipi | A A Kalıntıları* | Dizi^ |
| 16 | E6 52-61(10) | FAFRDLCIVY |
| 18 | E6 47-56 (10) | FAFKDLFVVY |
| 31 | E6 45-54 (10) | FAFTDLTIVY |
| 33 | E6 45-54 (10) | FAFADLTVVY |
| 35 | E6 45-54 (10) | FACYDLCIVY |
| 39 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 45 | E6 47-56 (10) | FAFSDLYVVY |
| 51 | E6 45-54 (10) | VAFTEIKIVY |
| 52 | E6 45-54 (10) | FLFTDLRIVY |
| 56 | E6 48-57 (10) | FACTELKLVY |
| 58 | E6 45-54 (10) | FVFADLRIVY |
| 59 | E6 47-56 (10) | FAFNDLFIVY |
| 68 | E6 47-56 (10) | FAFGDLNVVY |
| 73 | E6 45-54 (10) | FAFSDLCIVY |
* Amino asit sayısı parantez içinde gösterilmiştir.
^ HPV-16 E6 52-61 epitopundaki amino asit kalıntılarından farklı olanlar kalın yazı tipiyle gösterilmiştir.
Tablo 2. Çapraz tanımayı değerlendirmek için test edilen, HPV 16 E6 52-61 CD8 T-hücre epitoplarına homolog, yüksek riskli HPV tiplerinin peptid amino asit dizileri.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Geleneksel olarak immünologlar, ilgili T hücrelerini in vitro stimüle ederek ve epitopa özgü T hücre klonlarını izole etmek için sınırlayıcı dilüsyon deneyi gerçekleştirerek yeni T hücresi epitoplarını karakterize etmeye çalışmışlardır. Ardından, T hücresi klonları bir kromyum salınım analizi kullanılarak karakterize edilmiştir 8,9. Ancak, T hücrelerinin frekanslarının izole edilemeyecek kadar düşük olması veya karakterizasyonu tamamlamak için yeterli sayıda T hücresi klon hücresinin bulunmaması neden...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların beyan edilecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, bir Amerikan Kanser Cemiyeti Akademisyen Ödülü (RSG-06-180-01-MBC) ve NIH hibeleri (R01 CA143130 ve UL1RR029884) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| CD8 T hücresi izolasyon kiti | Miltenyi Biotec | 130-094-156 | |
| Fitohemaglutinin | Remel, Thermo Fisher Scientific | R-30852801 | 2mg/flakon |
| Yssel’ besiyeri | Gemini Bio Products | 400-102 | %1 havuzlanmış insan serumu |
| 96 kuyucuklu yuvarlak tabanlı plaka | BD Biosciences | 08-772-17 | |
| Rekombinan insan IL-2 | R&D Systems | 202-IL-050 | 50μg |
| 24 kuyucuklu plaka | Corning | 07-200-84 | |
| Fosfat tamponlu salin | Cellgro | MT-21-031-CV | |
| Primer anti-IFN-γ monoklonal antikor (D1K) | Mabtech | 3420-3-1000 | |
| Biotin konjuge anti-IFN-γ monoklonal antikor (7B-6) | Mabtech | 3420-6-1000 | |
| Multiscreen HA ELISPOT plakası | EMD Millipore | MAHA S45 10 | |
| Dimetil sülfoksit | Sigma-Aldrich | D2650 | 100 ml şişe |
| Havuzlanmış serum, insan | Atlanta Biologicals | S40510H | Isıyla inaktive edilmiş |
| RPMI 1640 | Cellgro | MT-10-040-CV | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287-100ml | |
| Vectastain Elite ABC Kiti | Vector Laboratories | NC9313719 | |
| Stabil diaminobenzidin | Open Biosystems | MBI 1241 | |
| AID EliSpot Reader Classic | Autoimmun Diagnostika GmbH | ELR06 |
Kaynaklar
- Nakagawa, M. A favorable clinical trend is associated with CD8 T-cell immune responses to the human papillomavirus type 16 e6 antigens in women being studied for abnormal pap smear results. J. Low. Genit. Tract Dis. 14, 124-129 (2010).
- Walls, E., Crawford, L. Lymphocytes: A practical approach. Klaus, G. G. B. , IRL Press. 149-149 (1987).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Patterns of CD8 T-cell epitopes within the human papillomavirus type 16 (HPV 16) E6 protein among young women whose HPV 16 infection has become undetectable. Clin. Diagn. Lab Immunol. 12, 1003-1005 (2005).
- Wang, X., Santin, A. D., Bellone, S., Gupta, S., Nakagawa, M. A novel CD4 T-cell epitope described from one of the cervical cancer patients vaccinated with HPV 16 or 18 E7-pulsed dendritic cells. Cancer Immunol. Immunother. 58, 301-308 (2009).
- Larsson, M. A recombinant vaccinia virus based ELISPOT assay detects high frequencies of Pol-specific CD8 T cells in HIV-1-positive individuals. AIDS. 13, 767-777 (1999).
- Nakagawa, M. Cytotoxic T lymphocyte responses to E6 and E7 proteins of human papillomavirus type 16: relationship to cervical intraepithelial neoplasia. J. Infect. Dis. 175, 927-931 (1997).
- Wang, X., Moscicki, A. B., Tsang, L., Brockman, A., Nakagawa, M. Memory T cells specific for novel human papillomavirus type 16 (HPV16) E6 epitopes in women whose HPV16 infection has become undetectable. Clin. Vaccine Immunol. 15, 937-945 (2008).
- Evans, M. Antigen processing defects in cervical carcinomas limit the presentation of a CTL epitope from human papillomavirus 16 E6. J. Immunol. 167, 5420-5428 (2001).
- Shi, Y., Smith, K. D., Kurilla, M. G., Lutz, C. T. Cytotoxic CD8+ T cells recognize EBV antigen but poorly kill autologous EBV-infected B lymphoblasts: immunodominance is elicited by a peptide epitope that is presented at low levels in vitro. J. Immunol. 159, 1844-1852 (1997).
- Varadarajan, N. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. The Journal of Clinical Investigation. , (2011).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Moscicki, A. B. Different methods of identifying new antigenic epitopes of human papillomavirus type 16 E6 and E7 proteins. Clin. Diagn. Lab Immunol. 11, 889-896 (2004).
- Nakagawa, M., Kim, K. H., Gillam, T. M., Moscicki, A. B. HLA class I binding promiscuity of the CD8 T-cell epitopes of human papillomavirus type 16 E6 protein. J. Virol. 81, 1412-1423 (2007).
- Brown, S. A. T cell epitope "hotspots" on the HIV Type 1 gp120 envelope protein overlap with tryptic fragments displayed by mass spectrometry. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 21, 165-170 (2005).
- Masemola, A. M. Novel and promiscuous CTL epitopes in conserved regions of Gag targeted by individuals with early subtype C HIV type 1 infection from southern Africa. J. Immunol. 173, 4607-4617 (2004).
- Walker, B. D., Korber, B. T. Immune control of HIV: the obstacles of HLA and viral diversity. Nat. Immunol. 2, 473-475 (2001).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
