İlköğretim İnsan Keratinositler gelen Organotipik Radye Kültürlerin Üretimi

Özet

Bir In vitro yöntemi In vivo Epitelyal farklılaşma tarif edilmektedir. Birçok virüs bulaşıcı yaşam döngüsünün bir parçası olarak epitel hücreleri hedef ve bu yöntem, virüsün incelenmesi için bir araç sağlar: konak etkileşimleri daha yakından oluştuğu benzediği In vivo. Bu tekniğin temel keratinositler, oluşturulan hücre çizgileri, aynı zamanda, normal veya hastalıklı biyopsi doku ile birlikte kullanılabilir.

Özet

Organotipik epitel sal kültürlerin gelişimi vitro sistemde sadakatle özetlediği epitel farklılaşmasında etkili olan araştırmacılar sağlamıştır. Bu sistem için bir çok kullanıma vardır. Örneğin, keratinositlerin üç boyutlu organotipik sal kültürleri yetiştirme yeteneğiyle, insan papilloma virüsü (HPV) ¹ çalışmalarında önemli bir kilometre taşı olmuştur. HPV yaşam döngüsü sıkıca skuamöz epitel ² farklılaşma bağlantılıdır. Olarak Organotipik epitel sal kültürler burada virüs üretimi ^3,4,5 dahil olmak üzere, tüm papillomavirus yaşam döngüsü yeniden gösterdi. Ayrıca, bu sal kültürler HPV ile in vivo enfeksiyon üzerine görülenlere benzerdir displastik lezyonlar gösterirler. Böylece bu sistem, aynı zamanda epitel hücre kanserleri, yanı sıra genel olarak epitel hücre farklılaşması üzerinde ilaçların etkisini araştırmak üzere de kullanılabilir. Başlangıçta Asselineau ve Prunieras tarafından geliştirilen ve ark. ⁷ tarafından değiştirilmiş, organotipik epitel sal kültürü sistemi üzerindeki kolajen hücrelerinin büyümesini içeren bir genel olarak, nispeten kolay kültürü modeli, haline geldi bir hava-sıvı arayüzü (Şekil 1A) muhafaza bağlanır. 10-14 gün boyunca, hücrelerin tabakalandırmak ve farklılığı, farklılaşma özgü Sitokeratin üreten bir tam kat epitel oluşturulması. Hasat sal yanı sıra standart moleküler ve biyokimyasal teknikler ile, histolojik olarak kontrol edilebilir. Bu yazıda, birincil insan keratinositlerinden sal kültürlerin üretimi için bir yöntem açıklanmaktadır. Aynı teknik kurulan epitel hücre çizgileri ile birlikte kullanılabilir, ve kolay bir şekilde, normal veya hastalıklı biyopsileri ⁸ den epiteliyal doku ile kullanım için uyarlanabilir. Birçok virüs hedef ya deri veya mukozal epitelin kendi replikatif yaşam döngüsünün bir parçası olarak. Son birkaç yılda, fizibilite organotipik sal kült kullanarakVirüs-konak hücre etkileşim okuyan bir yöntem olarak ures birkaç herpesvirüslerinin yanı sıra adenovirüsler, parvoviruses ve poxviruses ⁹ için gösterilmiştir. Organotipik sal kültürler böylece viral patogenez incelemek için uyarlanmış ve kalıcı hücre serilerinde tarıma olmayan bu virüs için antiviral ajanlarla test etmek için tek yöntem olabilir.

Protokol

1. Organotipik Raft Kültürler Hazırlık

1. Metal sal ızgaraları kadar ilk farklılaşma sürecine müdahale olabilecek artıkları temizlemek için kromik sülfürik asit ile tedavi edilebilir. Bir saat için sülfürik asit içeren bir cam beher içinde bırakın metal ızgaralar, daha sonra sürekli musluk suyu ile bir gece durulanmalıdır. Durulama gece sonra, radye ızgaraları çift distile su içinde 3-5 saat durulanmalıdır.
2. Sal destek sağlamak için, birbirinden eşit mesafede 0.5 cm radye üç tarafı bükün. Metal ızgaraları sonra otoklava edilmelidir.
3. 2,2 g NaHCO3 ve 4.8 g Hepes ekleyerek 10X sulandırma tamponu hazırlayın. 0.05 M NaOH 100 ml eritin. Filtre sterilize ve -20 ° C'de 5 ml hacimde depolamak
4. Sodyum bikarbonat olmadan 10X DMEM hazırlayın. Filtre sterilize ve -20 ° C'de 5 ml hacimde depolamak
5. Fare epidermal büyüme faktörü hazırlayın: EGF 100 mg ve B 10 mg eritilirSA 10 ml her GKD ₂ 0 deiyonize. EGF ve BSA birleştirin ve 100 ml toplam hacim deiyonize GKD ₂ 0 80 ml ​​ekleyin. Filtre sterilize, tablet (5 ml) ve -20 ° C'de saklayın E, orta her litre için 1 mg / ml EGF (nihai konsantrasyon 5 ng / ml), 5 ml ilave edilir.

2. Kollajen Jeller hazırlanması

1. Bir kollajen jel her salı için gereklidir. Kollajen katılaşabilme önlemek için buz üzerinde tutulmalıdır. Sıçan soğuk-kuyruk kolajeni tip I (nihai konsantrasyon 3-4 mg / ml), 0.3 ml 10X rekonstitüsyon tamponu, 0.3 ml DMEM 10X AND1-2 X 10 ⁶ fare 2.4 ml: her kollajen jel oluşan kollajen karışımı 3 ml gerektirir besleyici hücreler olarak 3T3 J2 fibroblastlar. Fare kuyruk kolajeni ile yüksek konsantrasyonlu çözümler için, doğru çalışma konsantrasyonu elde etmek için 0.02 M asetik asit içinde tamamlanır.
2. Eğer kolajen miktarı, 10X reconstit için bir master miks hesaplamak daha sonra ihtiyacınız olacak kollajen jel (sallar) sayısını belirlemekution tampon, 10X DMEM ve J2 fibroblastlar gereklidir. Kollajen viskozite nedeniyle 3-4 ekstra jeller için her ana karışım yeterli ekleyin.
3. Kollajen jel hazırlamak için, J2 fibroblastlar trypsinize ve orta ile nötralize. 50 ml'lik konik flakon tüm fibroblastlar ve yerde birleştirin. Yapılabilir sallar numarasını belirlemek için hücreleri hesaplama. Yine, 1-2x10 ⁶ fibroblastlar sal başına böylece kollajen jel başına gereken ve uygulanır. Düşük hızda hücreleri aşağı Spin.
4. 10X rekonstitüsyon tamponu, 10X DMEM ve hesaplanan salları sayısı için kolajen uygun miktarlarda fibroblast pelet ve Pastör pipetiyle gelen ortamı aspire. Hızlı katılaşmayı gelen jel önlemek için kolajen son ekleyin. Kollajen eklendikten sonra, jel içine kabarcıklarının giriş önlemek için hızlı bir şekilde yavaşça karışımı, fakat. Jel Doğru pH göstergesi kırmızımsı portakal rengi, olmalıdır. Jel karışımı aşırı sarı ise, filtre ile sterilize 1N damla bir çift eklemeNaOH ve karışımı yavaşça doğru renk elde etmek.
5. Kollajen 3 ml ekleyin: fibroblast karışımı 6 kuyu kültür yemeğin kuyulara. Kollajen karışımı kabarcıklar oluşturarak önlemek için yavaş yavaş her iyi tarafı aşağı pipetlenir edilmelidir. Bir 37 ° C doku kültürü plakası inkübatörde yerleştirin ve 30 dakika boyunca katılaşmaya izin verir.
6. 30 dakika sonra, katılaştırılmış kollajen jel üst EGF E orta 3 ml ekleyin ve plaka inkübatöre geri döner. Jeller, en az bir gün boyunca 37 ° C'de tutulur, ancak dört gün içinde kullanılmalıdır. Optimal sonuçlar inkübasyon iki gün sonra ortaya çıkar.

3. Farklılaşma için hazırlık Keratinositler

1. Düşük geçit keratinositler yaklaşık% 70 konfluense büyüdü edilmelidir. Her salı 1-2x10 ⁶ keratinositler gerektirir. Keratinositler Trypsinize ve EGF ile E orta ile nötralize. Yapılabilir sallar numarasını belirlemek için hücreleri hesaplama. Düşük SPE olarak hücreleri aşağı Spined. Hesaplanan her sal kültürü için EGF ile E ortamın 1 ml pelletini.
2. Eğerek 6 sıra plaka ile kollajen jel gelen orta aspire. Her jel EGF taze E orta 2 ml ekleyin. Her jel için, dikkatle de zaten mevcut E orta 2 ml süspanse keratinositlerin 1 ml ekleyin. Sonra yavaşça pipet keratinositlerin artı medyanın 2 ml ve sonbahar açılan akıllıca geri jel üzerine izin verin. Çalkalama veya plaka sallanan kollajen jel bir tarafında hücrelerinin düzensiz dağılımı ile sonuçlanabilir. 37 ° C inkübatörde plakası yerleştirin.
3. Hücreler günlük E orta yerine, konfluent için yetiştirilen edilmelidir. Hücreler konfluent olduğunda, orta bir değişiklikten sonra sarı bir gün için orta değişir. Bu genellikle 2-4 gün sürer. Orta günde dört tarafından değişmedi, bir sonraki adıma geçin.

4. Radye Kültürler yapma

1. Steril bir metal sal ızgara yerleştirmek için steril forseps kullanma, taraf eğildi, Bir 10 cm çanak içine. Kollajen jelden orta aspire. İyi bir taraftan jel gevşetmek için, hareketli bir yukarı ve aşağı kullanılarak steril bir spatula ile jel çevresi etrafında gider. Kollajen jel kaldırmak için hafifçe eğin plaka ve bir spatula altına koyarak kaldırın. Izgara ve jel arasındaki kabarcıklar oluşturmadan metal ızgara üzerinde kollajen jel yatırın. İki jeller her ızgara üzerine yerleştirilebilir.
2. Bir hava-sıvı arayüz hale getirmek için, sal ızgara ortam dokunmadan böylece tabağın tabanına kadar yavaş EGF olmadan E orta ilave fakat kollajen jel değildir. Medya kılavuzunda deliklerden gelmemeli. Bu tip farklılaşmasını önlemek olacak şekilde, kılavuz altında kabarcıkları üretmek önlemek için yavaş yavaş ortam ekleyin. 37 ° C'de inkübe sallar ve hava-sıvı arayüzü koruyarak her geçen gün orta değiştirin. 14 gün sonra hasat sallar.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Zaman tO protokolü primer keratinositler ile düzgün bir şekilde gerçekleştirilir, bu işlem cilt katman değişik belirgindir iyi farklılaşmış epitel neden olacaktır. Bu Şekil 1B gösterildiği hematoksilen ve eozin (H & E) sal kültürler, bölümleri boyanarak histolojik inceleme ile elde edilebilir. H & E boyama sallar ve tabakalandırmak ve ayırt hücrelerinin yeteneği üzerinde virüs veya antiviral bileşiklerin etkisi morfolojisini incelemek de faydalıdır. Örneğin, HPV-ölümsüzleştirdi birincil insan keratinositleri (HFK-31) yapılan sallar özellikle kalın çoğalması oranında herhangi bir artış ve farklılaşma hücreleri aktif tutmak için HPV proteinlerin yeteneğini yansıtan, normal insan sünnet derisi keratinositleri (HFK) yapılan sallar karşılaştırıldığında hücre döngüsü içinde (Şekil 1B) ^10. Epitel boyunca çekirdeklerin tutulması Bu sonuç, normal keratinositlerin bir arıza ile sonuçlanan farklılaşma üzerine hücre döngüsü çıkmak iseçekirdek zarı. Daha yakından incelemek için farklılaşma, immünhistokimya Sitokeratin yanı sıra involukrin ve filagrin gibi özel farklılaşma belirteçler, incelemek için yapılabilir. Farklı Sitokeratin farklılaşma ⁷ spesifik aşamaları ile ifade edilir. Şekil 2 de gösterildiği gibi, sitokeratin 10 (K10) taban katmanı olarak ifade değildir ve tek aşamalı olarak ayırt hücreleri içerir suprabasal tabakalar halinde bulunur. HPV pozitif sallar olarak, K10 ifadesi tekrar keratinosit farklılaşma HPV proteinlerinin etkisini yansıtan Normal keratinositler kıyasla gecikir. İmmünohistokimya da viral genlerin ifadesi profili incelemek için kullanılabilir. Şekil 3'te gösterildiği gibi ifade epitelinin üst tabaka ile sınırlıdır geç bir proteindir HPV proteini E1 ^ E4, ifade inceleyerek bir temsilcisi olan boyama. Beklenildiği gibi, herhangi bir boyama, normal huma gelen sal kültürlerinde görülmektedirSünnet derisi keratinositler n.

Şekil 1. Primer keratinositler ya epitel hücre hattından organotipik sal kültürler hazırlanması için yöntem A) içeriği. Stably HPV-31 (HFK-31) episomes veya normal insan sünnet derisi keratinositleri (HFK) den korumak, insan sünnet derisi keratinositlerinden oluşturulan organotipik sal kültür B) Hematoksilen ve eozin boyanma. Bireysel epiteliyal tabakalar yanı kollajen tıkaç olarak tespit edilir.

Şekil 2. Sitokeratin 10 (K10) ifade epitelin suprabasal katmanları ile sınırlıdır. İmmünohistokimya K10 için bir antikor kullanılarak HFK-31 hücreleri, hem de normal bir HFKs elde organotipik sal kültürlerin kesitleri üzerinde yapıldı. Hücresel DNA DAPI ile zıt edildi. Görüntüler conf kullanılarak çekilenÖcal floresan mikroskobu. Oklar epitelin bazal tabaka göstermektedir.

Şekil 3. HPV E1 ^ E4 proteini geç virüs ömrü çevrimi ile verimli bir faz olarak üretilir. İmmünohistokimya E1E4 karşı antikorlar kullanılarak HFK-31 hücreleri, hem de normal bir HFKs elde organotipik sal kültürlerin kesitleri üzerinde yapıldı. Hücresel DNA DAPI ile zıt edildi. Görüntüler konfokal floresan mikroskobu kullanarak ele geçirildi. Oklar epitelin bazal tabaka göstermektedir.

Tartışma

Burada genel olarak epitelyal farklılaşma incelemek için kullanılabilecek bir yöntem tarif eder, fakat, aynı zamanda kolaylıkla viral patogenezine gibi potansiyel terapötik etkinlik incelemek için adapte edilebilir. Birçok virüs herpesvirüslerinin ile olduğu gibi, HPV durumunda olduğu gibi, ya da virüs ömrü çevrimi içinde bir noktada, enfeksiyon primer olarak ya epitel hücreleri hedef. Konak hücre etkileşimleri: organotipik sal kültürler büyüyen zaman alıcı, virüsü incelemek için son derece yararlı bir yöntem sağlar sad...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası
Sıçan Kuyruk Kollajen tip 1 (4-5mg/ml)	BD Biosciences	354236
NaHC0 3 olmadan DMEM	Invitrogen	12100-061
NaHC0 3	Sigma	S5761
Hepes	Calbiochem	391338
Paslanmaz çelik metal ızgaralar	Williams ve hırs A.Ş.	CR-03063-040-100-S
E orta 11
Epidermal Büyüme Faktörü	BD Biosciences	354010