Önceden hazırlanmış alıcı suşlar olarak adlandırılan iniş takımı suşları, içine faiz yabancı DNA entegre hızlı ve verimli bir yöntem tarif edilmiştir. Metodu ΦC31 integraz konjugasyonu ve ifadesi ile, belirli bir lamine suşun iniş pedi odağına içine bir DNA kasetinin site-specific entegrasyon sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Siteye özgü Bakteriyel Kromozom Mühendislik: ΦC31 integraz Aracılı Kaset Borsası (IMCE)
Bu makalede
Özet
Özet
Bakteriyel kromozom stably Mega baz aralığında 1 yabancı DNA korumak için de kullanılabilir. Kromozom entegrasyon gibi plazmid çoğaltma, plazmid istikrar, plazmid uyumsuzluk ve plazmid kopya sayısı varyans gibi konular circumvents. Bu yöntem, Streptomyces faj (Φ) C31 2,3 den site-specific integraz kullanır. AttB ve attP (sırasıyla 34 ve 39 bp) 4: ΦC31 integraz iki spesifik DNA bölgeleri arasında doğrudan bir rekombinasyon katalizler. Bu rekombinasyon istikrarlı ve 5 geri almaz. Bir spectinomycin-direnç geninden, Aada (SPR), ve E. oluşan A "tampon iniş" (LP) sekansı attP siteleri çevrili coli ß-glukuronidaz geni (uidA) Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi ve bir intergenik bölgede Agrobacterium tumefaciens kromozomlarını entegre edilmiştir, duyuyorumsırasıyla pC odağı ve teta odağı,. S. meliloti Bu protokolde kullanılır. Bir stuffer kırmızı floresan proteini (rfp) geni ve antibiyotik direnç geni kuşatan attB siteleri içeren Mobilizable donör vektörler aynı zamanda inşa edilmiştir. Bu örnekte gentamisin dirençli plazmid pJH110 kullanılır. RFP geni 6 SPH I ve Pst I ile istenen yapı ile ikame edilebilir Alternatif attB siteleri tarafından çevrili sentetik bir yapı gibi pK19mob 7 gibi bir mobilizable vektörüne alt-klonlandı olabilir. ΦC31 integraz geni (pHS62 8 den klonlanmış) ile ifade pRK7813 9 plazmid bir mobilizable geniş bir aralığı üzerinde ana, lac promotör tarafından tahrik edilir.
Bir eşleşme tetraparental protokolü LP suşu böylece donör kaset ile LP sırayla değiştirme belirteçler içine donör kaset transfer etmek için kullanılır. Bu hücreler vardır trans-integrants. Trans-integrants% 0.5 arasında, tipik bir verim ile oluşturulanlardır. Trans-integrants tipik olarak 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D-glukuronik asit (X-gluc) kullanılarak antibiyotik duyarlılığı veya mavi-beyaz tarama ile taranmıştır olanlar 500-1,000 koloniler içinde bulunurlar. Bu protokol, trans-integrants oluşturma ve izole etmek için çiftleşme ve seçme işlemleri içerir.
Protokol
1. Kültür Üretimi
- TY 10 (5 g / l tripton, 3 g / l maya ekstresi, 0.44 g / l kalsiyum klorid dihidrat), ve LB 11 (10 g / l tripton, 5 g / L maya ekstresi, 5 g /: steril sıvı ortam hazırlamak sodyum klorid, pH 7).
- SmUW227: 50 mg / ml spectinomycin ile TY medya (S. meliloti LP-suşu: inşaat kodlanabilir, istek üzerine inşaat detayları zorlanma) () 5 ml içine tek bir koloni inoküle. E.: verilen antibiyotik ile ilave aşağıdaki suşlar LB sıvı ortamları 5 ml içine inoküle coli DH5α 12 10 ug / ml tetrasiklin pJC2, plazmid integraz ifadesi, içeren; E. coli 10 ug / ml Kloramfenikol ile MT6....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
IMCE tekniği önceden tasarlanmış suşu LP-lokusunda tek bir attB çevrili DNA kaset verimli entegrasyon sağlar. Istenen yapı donör kaset oluşturmak için RFP yerine klonlanmış sonra, tekniğin son derece güçlü hale, müteakip DNA arıtma ve dönüşüm gerektirmez. Bu antibiyotik direnci trans-integrants ve diğer değil faktörlerin oluşturulması nedeniyle belirli olabilmesi için, uygun büyüme kontrolleri dahil olduğunu önemlidir.
IMCE yaklaşık% 0.5 verimle trans-integrants üretir. Bun.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
Nazik integraz klon sağlamak için CM Margaret Smith
Destek finansmanı:
Genom Kanada / Genom Prairie
NSERC Discovery ve Stratejik Proje hibeleri
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| Streptomisin | Bioshop Kanada A.Ş. | STP101 | |
| Spectinomycin | Bioshop Kanada A.Ş. | SPE201 | |
| Gentamisin | Bioshop Kanada A.Ş. | GTA202 | |
| Choramphenicol | Bioshop Kanada A.Ş. | CLR201 | |
| Tetrasiklin | Bioshop Kanada A.Ş. | TET701 | |
| Kanamisin | Bioshop Kanada A.Ş. | KAN201 | |
| Bakteriyolojik notu agar | Bioshop Kanada A.Ş. | AGR001 | |
| Tripton | Bioshop Kanada A.Ş. | TRP402 | |
| Maya Ekstraktı | Bioshop Kanada A.Ş. | YEX401 | |
| Sodyum klorür | Bioshop Kanada A.Ş. | SOD001 | |
| Kalsiyum Klorür | Bioshop Kanada A.Ş. | CCL444 | |
| X-gluc | Altın Biyoteknoloji A.Ş. | G1281C1 | |
| E. coli suşu MT616 | Istek üzerine | Ayrıca laboratuar dışında kullanılan | |
| E. coli suşu pJC2 | Isteği ile evde, mevcut | ||
| E. coli suşu pJH110 | Reques tarafından evde, mevcutt | ||
| SmUW227 gerginlik | Isteği ile evde, mevcut |
Kaynaklar
- Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).
- Kushtoss, S., Rao, R. N.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
