İlköğretim İnsan naif ve Bellek T Hücreleri gelen İsteyerek Düzenleyici T Hücreleri Üretimi

Özet

Biz tek bir insan kan bağışında düzenleyici, bellek ve naif T hücreleri oluşturmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Polarize Tregs sonra da burada ayrıntılı bir bastırma testi dahil olmak üzere genetik homojenlik ile genetik ve fonksiyonel uygulamalar çeşitli diğer komutlara göre olabilir.

Özet

Immünsupresif CD4 ⁺ düzenleyici T hücreleri (Tregs) geliştirilmesi ve bakım ve insan bedeni üzerinde kendini ve ortakçı antijenlerin büyük miktarda immünolojik homeostazisde kalmak için ihtiyaç duyulan periferik tolerans katkıda bulunur. Tregs ve inflamatuvar konvansiyonel T hücrelerinin arasındaki dengeye Pertürbasyonu İmmünopatolojiye veya kansere neden olabilir. Tregs terapötik enjeksiyon kolit, ^1, tip I diyabet ^2, romatoid artrit ve graft versus host hastalığı, insan karşı fare Treg biyolojisi ⁵ in ⁴ birkaç temel farklılıklar murin modellerinde etkili olduğu gösterilmiştir olmakla birlikte şimdiye kadar klinik kullanımı engellemiştir sahiptir. Yeterli sayıda, saflık, stabilite ve terapötik Tregs yuvalandırma özgüllük eksikliği kendi ex vivo genişlemesi ⁶ koşulları optimize etmek için hangi insan Treg gelişimi dinamik bir platformu gerektirmiştir.

Burada beğendimdört aşamadan ayrılabilir tek bir insan periferik kan donörden bağlı Tregs (iTregs) farklılaşması için bir yöntem escribe: periferik kan mononükleer hücreleri, CD4 manyetik seçimi ⁺ T hücre izolasyonu, in vitro hücre kültürü ve floresan aktive T hücre alt gruplarının hücre sıralama (FACS). Treg imza transkripsiyon faktörü forkhead kutusu P3 (FoxP3) insanlarda ⁷ aktivasyon bağlı transkripsiyon faktörü ve hiçbir diğer benzersiz belirteç var, damgalı bir kombinatoryal paneli baskılayıcı aktivite ile T hücrelerini tanımlamak için kullanılması gerekir beri. Kültüründe altı gün sonra, sistemindeki hücrelerin saf T hücreleri, CD25 ve CD45RA bunların bağıl ifade göre bellek T hücreleri veya iTregs içine olarak belirli edilebilir. Bellek ve naif T hücrelerinin farklı rapor kutuplaşma gereksinimleri ve plasticities ⁸ sahip olduğu gibi, CD45RA ⁺ ve CD45RO içine ilk T hücre popülasyonunun öncesi sıralama ⁺ alt kümeleri olabilir be bu farklılıklar incelemek için kullanılır. Diğerleri ile uyumlu olarak, bizim CD25 ^Hi CD45RA ^- FoxP3 ⁹ iTregs ekspres yüksek düzeyde, GITR ve CTLA-4 ¹¹ ve CD127 ¹² düşük seviyelerde. Her nüfusun FACS ardından, elde edilen hücreler carboxyfluorescein süksinimidil ester (KAKE)-etiketli T hücrelerinin proliferasyonu otolog geciktirmek üzere göreli yeteneği hesaplayan bir bastırma deneyde kullanılabilir.

Protokol

1. Buffy Coat gelen İnsan periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) İzolasyonu

1. Hastane veya yakındaki kan merkezi yerden buffy coat bir birim edinin. Bizim kan merkezi normal kan vericilerden elde birim buffy coat, 40-60 mL bize sağlar.
2. Buffy coat sulandırmak için steril PBS içeren bir otoklav 500 ml cam şişe içine kan dökün. PBS + buffy kaplamanın son hacim 250 mL olmalıdır.
3. 20 mL Lymphoprep çözeltisi ile, her on 50 ml konik tüpler doldurun.
4. Yavaşça Lymphoprep çözüm rahatsız dikkat ederek, seyreltilmiş buffy coat 25 mL Lymphoprep çözüm bindiriyoruz.
5. 500 x g hızında, oda sıcaklığında 30 dakika boyunca boru dönerler. Lenfosit fraksiyonu rahatsız etmeyecek şekilde, santrifüj fren kapalı olduğundan emin olun.
6. Bir pipetle Lymphoprep ve plazma orta katman arasındaki ara yüzeydeki PBMC'ler Collect. Yaklaşık 1 mL kadar plazma-orta off aspirehala PBMC içeren buffy coat katmanı kapsar. Yeni bir 50 ml tüp PBMC'leri transfer etmek için 10 ml pipet kullanın.
7. PBS ile iki kez yıkanır ve ardından hücreler bir hemasitometre ile ilgili sayım için soğuk RPMI 50 mL içerisinde yeniden süspanse hücreleri. 1 x 10 ⁹ PBMC'leri - Tipik kurtarma 8 x 10 ^8'dir.

Bu işlem kan küçük miktarlar için küçültülmüş olabilir. Tam kan numuneleri seyreltilmesi PBS ile 1:1 dir.

2. Toplam CD4 Manyetik Negatif Seçim ⁺ T hücreleri, CD4 ⁺ CD45RA ⁺ naif T hücreleri veya CD4 ⁺ CD45RO ⁺ EasySep Zenginleştirme Kitleri kullanarak PBMC'leri gelen Bellek T Hücreleri (Kök Hücre Teknolojileri)

4.25 x 10 ⁸ PBMC'leri 1 x 10 ⁸ izlenmesi için basamakları.

1. % 2 FBS ve 1 mM EDTA içeren PBS ile mL başına 5 x 10 ⁷ arasında bir nihai konsantrasyona Pastör pipetiyle PBMC'ler. Taze bir 14 mL polipropilen yuvarlak dipli bir tüp hücreleri taşıyın.
   1. Toplam insan CD4 ⁺ T hücreleri negatif seleksiyon tarafından izole edilmesi: insan CD4 ⁺ T hücre Zenginleştirme antikorların kokteyli (PBMC mL'si başına 50 ul) karışımı ile oda sıcaklığında 10 dakika inkübe ekleyebilir.
   2. Negatif seleksiyon insan saf T hücrelerinin izolasyonu: PBMC hücre süspansiyonu, karışım mL'si başına anti-CD45RO antikorun 50 uL ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika süreyle inkübe edilir. 10 dakika için oda sıcaklığında kiti (PBMC ve mL başına 50 ul) eklendi ve karışım inkübe ile sağlanan zenginleştirme kokteyli ekleyin.
   3. Negatif seleksiyon insan bellek T hücrelerinin izolasyonu: insan Bellek CD4 ⁺ T hücre antikorların Zenginleştirme kokteyli (PBMC mL'si başına 50 uL), karıştırılır ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle inkübe edilir.
2. Eşit çözüm bunların dağıtımını yapmak için de manyetik parçacıklar karıştırın. Naif kiti girdap değil nanopartiküller yapın.
3. Manyetik parçacıkların (100 toplam CD4 PBMC'ler mL'si başına uL ⁺ ve saf T hücre seçimi, bellek T hücresi seçimi için PBMC'ler mL'si başına 50 uL) ilave edilir. Yavaşça saf T hücresi seçimi için 10 dakika veya bellek ya da total CD4 ⁺ T hücresi seçimi için 5 dakika için oda sıcaklığında 2-3 kez ve inkübe pipet ile karıştırılır.
4. PBS kadar tüp başına 10 ml hacim getirmek için% 2 FBS ve 1 mM EDTA ihtiva eden ekleyin. Yavaşça toplam CD4 ⁺ T hücreleri, naif ve bellek alt için sırasıyla 5, 10 veya 2.5 dakika için gümüş EasySep cazibe merkezi haline kapağını açıp tüpü yerleştirmeden önce 2-3 kez pipetleme ile karıştırın.
5. Hala EasySep mıknatıs tüpü ile ilgi hücrelerin izole yeni 50 ml tüp içine sıvı dökün.
6. Adımları 2.5 ve daha iyi kurtarma için 2.6 tekrarlayın.

3. Hücre Kültürü Koşullar Düzenleyici T Hücreleri tetikleyebilecek

1. Tarafından adım 1 ve 2, katı doku kültür plakaları öncesi gün birinci (anti-CD3 antikoru seyreltilmesiSteril PBS içinde 1 mg / mL bir konsantrasyona OKT3 klonu). 6 sıra plaka 2 mL PBS + iyi başına anti-CD3 eklemek için, 12 de plaka 1 ml için veya 24 de plaka için her kuyuda 500 uL ekleyin. Kaplama plakası 4 ° C'de, kullanılıncaya kadar devam edin.
2. RPMI-1640 2,06 mM ile ön-takviye Glutamax-I ve 25 mM kadar% 10 ısı-inaktive edilmiş fetal bovin serumu (FBS), 100 U / ml penisilin, 100 ug / ml streptomisin ve 50 uM β-merkaptoetanol ekleyerek polarizasyon orta hazırlamak HEPES tamponu. Ardından, 2 ng / ml TGF-β ve 5 ng / ml IL-2 ilave edin. Burada, bir ligandları ya da ortam ilgi inhibitörleri ekleyebilir. 2 x 10 ⁶ hücre / polarizasyon orta mL 'lik bir konsantrasyonda adım 2'de elde edilen hücreleri tekrar süspansiyon.
3. 37 öncesi sıcak plakaları ° C ve hücreleri eklemeden önce, anti-CD3 kaplı kuyuların PBS dışarı aspire. Bir 6 kuyulu plakanın bir 24 kuyulu plakanın bir 12 kuyulu plakanın veya hücre 1 mL için hücreler 2 mL için 4 mL başına de hücre süspansiyonu ilave edin. Buharlaşmasını azaltmak için PBS ile boş kuyu doldurunmedya. 37 ° C _/% 5 CO2 de 3 gün süreyle inkübe edilir.
4. 3. gün sonrası kaplama üzerine, 500 x g'de 5 dakika santrifüj plaka aşağı spin. Plakanın altındaki T hücreleri bozmadan, medya yarısı kaldırmak ve taze ortam ile değiştirin. Iyi hücrelerin (3 x 10 ⁶ / ml 'nin üzerinde konsantrasyon) ile kalabalık olur Alternatif olarak, eğer eşit başka bir anti-CD3 kaplı plaka içine hacmi bölmek ve özgün birime geri taze medya ekleyebilirsiniz. 37 ° C _/% 5 CO2 az 2-3 gün daha inkübe.

4. T Hücreler üç Populasyonlarının Floresans-Aktif Hücre Sıralama (FACS)

1. Steril PBS ile% 0.5 (w / v) sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM EDTA ilave edilerek tampon yıkama FACS hazırlayın. 4 yer tampon ° C soğuk olsun.
2. De hücre kültürü hücreleri çıkarın ve tam hücre iyileşme sağlamak için 2 mL PBS ile her iyice durulayın. 50 ml polipropilen tüpler tüm hücrelere yerleştirin ve 10 için 500 xg'de santrifüjdakika 4 ° C.
3. Hücre yoğunluğu belirlemek için bir hemasitometre ile ilgili hücreleri hesaplama.
4. Yeri 3-5 tazminat kontrolleri için dört ayrı 5 mL'lik yuvarlak dipli polistiren tüplerde tüp başına x 10 ⁵ hücre. 50 ml polipropilen tüpler, tüp başına bir daha 35 x 10 ⁶ hücre kalan hücreler yerleştirin.
5. 4 ° C ve aspirat medya az 5 dakika hücreleri aşağı Spin. 1 x 10 ⁶ hücre başına soğuk yıkama tamponu 90 uL sıralanabilir hücreleri yeniden süspanse edin. Soğuk yıkama tampon kompanzasyon kontrolü tüplerin 100 uL içinde süspanse edin.
6. Sıralanması için hücreleri, anti-CD25-PE 2 uL, anti-CD45RA-PE-Cy5 3 uL ve 1 başına anti-CD127-APC 1 x 10 uL ⁶ hücreleri birleştirir. Dördüncü tüpüne anti-CD127-APC üçüncü tüp AND1 uL için PE-Cy5 ^- İlk dengeleme kontrol tüpü, ikinci bir tüpe anti-CD25-PE 2 uL, anti-CD45RA 3 uL için bir antikorla ekleyin. Karanlıkta 45 dakika süreyle buz üzerinde inkübe tüplerin her.
7. sıralanmasını hücreleri ve kompanzasyon kontrolü tüplere 1 ml soğuk yıkama tamponu 10 ml ekleyin. 4 az 5 dakika boyunca 500 xg'de tüm hücreleri santrifüjleyin ° C
8. Yıkama tamponu mL'si başına 1 x 10 ⁷ hücreleri arasında derişimde tampon ve Pastör pipetiyle hücreleri aspire. Bir 40 uM naylon hücre süzgecinden filtreleme önce hücreler mL'si başına DNase II 1,5 uL ekleyin. Tüp başına en fazla 3.5 'den ml ile birden 5 mL'lik yuvarlak dipli polipropilen tüplere hücreleri taşıyın. Tampon yıkama 300 uL tazminat kontrol hücreleri süspansiyon hale getirin.
9. PE, APC ve PE-Cy5 filtreleri tarafından çapraz algılama en aza indirmek için MoFlo akış sitometresinde tazminat ayarlayın. 1 ml doğmuş buzağı serumu içeren 5 mL'lik yuvarlak dipli polistiren tüpler içine T hücreleri, naif (CD25-CD45RA ⁺⁾ ve bellek (CD25 ^{- -} CD45RA) ^- iTregs (hücreler CD25 ^Merhaba CD127 ^-/LOW CD45RA) sıralamak için kapıları ayarlayın.

5.. Bastırma Assay

1. Suppr olunession assay 100 U / ml penisilin, streptomisin 100 ug / mL, 5 ng / ml IL-2 ve TGF-β için AMACI-V 2 ng / ml ortamı eklenerek.
2. Tahlil günü, heterolog CD4 ⁺ gibi adım 1 ve 2 de gösterilen buffy tabaka den T hücrelerinin saflaştırmak. Bu deney için bastırma hedef hücreler olacak ve Şekil 2, gün 0 görülebileceği gibi, CD25 ⁺ Treg hücreleri içermez.
3. Hücreleri yerine 2 uL mL'si başına 5 mM stok çözeltisi, sadece 1 uL kullanılması haricinde, üreticinin talimatlarına uygun olarak CellTrace kiti ile etiket hücreleri,. Doğrudan ışıktan uzak tutmak, 5 mM stok çözelti yapmak için KAKE bir şişeye CellTrace kit tarafından verilen DMSO 18 uL ekleyin. 1 x 10 ⁶ hücre / mL 'lik nihai bir konsantrasyona önceden ısıtılmış PBS +% 0.1 (w / v) BSA hedef hücrelerin gerekli numarası (1 x 10 ⁷ maksimum) tekrar süspansiyon. Hücreler mL'si başına 5 mM KAKE 1 uL ekleyin ve 5 minut için bir 37 ° C'de su banyosunda inkübees. Boyama gidermek ve 5 dakika buz üzerinde inkübe% 10 FBS ile komple, buz RPMI 5 hacim ekleyin. Soğuk tam RPMI ve Pastör pipetiyle 1 ile iki kat daha fazla hücre x 10 bastırma tahlil medya 100 uL başına ⁵ hücreleri. Yıkayın
4. Treg bastırma müfettişi boncuk 2 x 10 ⁷ boncuk / mL stok konsantrasyonda bulunmaktadır. Boncuklar pelet bir sayı, bir Eppendorf tüpüne hızlı santrifüjleme ile deneyi başına hücre sayısına eşit toplam. RPMI ve yeniden pelet ile bir kez boncuk yıkayın. RPMI aspirasyonu sonra, Pastör pipetiyle boncuklar çok iyi başına boncuk uygun miktarda supresyon testi medya 8 uL olduğunu.
5. Bir 96 yuvarlak alt doku kültürü plakası için istenen hedefe KAKE lekeli hücreleri (1 x 10 ⁵ hücre / ml), müfettiş boncuk ve taze bastırma tahlil medya kutuplaşmış ve sıralanmış hücreleri (1 x 10 ⁵ hücre / ml) ekleyin (KAKE lekeli): 200 ul'lik bir son hacim efektör (sıralanmış) oranı. Tüm koşullar tripli ayarlanırCates.
6. Çukur başına 92 uL bastırıcı deney ortamı içinde KAKE boyalı hücrelerin 100 uL, denetiminde boncuklar 8 uL ve taze, boyanmamış hücrelerin 1 x 10 ⁵ ekleyerek iki kontrol koşullar birinci hazırlayın. Yukarıdaki aynı hücresel bileşenleri ile ancak müfettiş boncuk Treg olmadan ikinci denetim hazırlayın.
7. Beş gün boyunca 37 ° C /% 5 CO ₂ alüminyum folyo ve inkübe levha örtün.
8. Karanlık, bir 5 mL'lik yuvarlak dipli polistiren tüp pipetleme ve yerde her kuyudan hücreleri toplamak. 4 ° C, aspirat medya az 5 dakika boyunca 500 xg'de hücreleri santrifüjleyin ve adım 4 tampon yıkama 300 uL soğuk FACS içinde yeniden süspanse. Ilk 3 x 10 ⁴ KAKE ⁺ Hücre Görev yazılımı ile bir histogram hedef hücreleri temsil eden canlı lenfosit kapısından olayları analiz edin.

6. Temsilcisi Sonuçlar

Akım sitometrik Pseudocolor Örneği beş günlük bir zaman cou içinde araziler noktarse izleme iTreg farklılaşma FoxP3 ile CD25 müşterek ifadesinden nispi göre, CTLA-4 ve CD45RA Şekil 2'de görülebilir. Şekil 3 histogram iTregs (CD25 ^Hi CD45RA ^- CD127 ^-/LOW hücreleri) sıralanır hangi başarılı bir supresyon testi gösterir. Düzenleyici baskılayıcı / yeteneği kazanmış bir beş günlük kültürden sadece alt kümesidir Şekil 4 Tregs indüksiyonu gösterir naif bir T hücre havuzu (üst paneller) ve standart iTreg orta beş günlük kültür sonrası bir bellek T hücre havuzu (alt paneller), dan. İlk hücrelerin KAKE boyanması ya naif (sağ üst panel) veya bellek T hücreleri (sağ alt panel) sadece hücre bölünmesi birkaç tur sonra iTregs (en yüksek FoxP3-salgılayan hücre) için ayırt göstermektedir.

Şekil 1. Deneysel işlemin şematik. PBMC arT hücreleri ^- CD4 ⁺ CD25 negatif manyetik seçimi öncesinde gradient santrifüj yoluyla insan periferik kan dışarı ayrılmış e. Kültüründe 5-6 gün sonra, hücrelerin FACS geçmesi ve baskılayıcı aktiviteyi ölçmek için, heterolog KAKE etiketli hedef hücreler ile birlikte inkübe edilir.

Şekil 2 saflaştırılmış insan primer CD4 ⁺ CD25 ^-. T hücreleri, orta iTreg kültürlenmiştir. Bir hücre porsiyonunun CD45RA, FoxP3, CTLA-4 ve CD25 belirteçlerin ilerlemeyi izlemek için sadece izolasyon (gün 0) sonra ve 1, 3 ve hücre kültürü 5 toplanır. ITreg profili CD45RA karşılık ^- FoxP3 ^Merhaba, CTLA-4 ve CD25 ^{Merhaba Merhaba} (in-grafik penceresinde vurgulanır).

Şekil 3. ⁺ KAKE la CD4 Safbeled hücreleri (1 x 10 ⁵ / kuyu) sıralanır saf, belleğe ya da iTreg hücreleri varlığında bastırılması müfettişi boncuklar Treg ile kültüre edilir (3 x 10 ⁴ / çukur). Beş gün sonra, hücreler hasat edilmiş ve lekeli hücrelerin KAKE profili akış sitometresi ile analiz edilir. ITreg hücrelerinin varlığında tamamen CD4 ⁺ T hücreleri çoğalması ortadan kaldırmaktadır. Sayılar bölünme geçirmiş KAKE etiketli hücrelerin yüzdesi göstergesidir.

Şekil 4 insan birincil naif Arıtılmış. (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RA ⁺⁾ ve bellek (CD4 ⁺ CD25 ^- CD45RO ⁺⁾ T hücreleri KAKE ve orta iTreg kültürlerinde ile boyanmış. Beş gün sonra, hücrelerin phenotyped ve hücre bölünmesinin oranları tahmin edilmektedir. Şekil 2'de gösterildiği gibi, her iki alt kümesi ayırt iTreg alt tekabülCD45RA ^- CD25 ^Merhaba FoxP3 ^Hi ve CTLA-4 ^Merhaba (son iki gösterilmemiştir). Karşılaştırmalı KAKE boyama profilleri beş günlük kültür sırasında en proliferatif hücreler olarak iTregs (burada en yüksek ifade FoxP3 T hücreleri gibi) tespit etti.

Tartışma

Treg transferi, bunların verimli üretimi ve istikrarlı bakım yöntemleri otoimmünite rejeksiyon ve diğer immün veya inflamatuvar aracılı hastalıklar ile mücadelede çok büyük tedavi umut vaat ederken henüz geliştirilmiş değil. Insan T hücreleri dolaşımdaki sadece% 1-5 Tregs oldukları için kontrollü genişleme ve farklılaşma kliniğe Tregs uygulanması önemli bir caydırıcı olarak bu yetersizlik üstesinden gelir. Bu deneme TGN1412 ¹³ öğrenilebilir gibi, diğer yandan, bu derece moleküler olayları anlamak için bilimse...

Malzemeler

Reaktif Adı	Şirket	Katalog Numarası	Yorumlar
Lymphoprep	Eksen-Shield	1114547	Oda sıcaklığında tutmak
Soğutmalı Tezgah Üstü Santrifüj	Eppendorf	5810R
Parlak-Line hemositometre	Hausser Bilimsel	3110
EasySep İnsan CD4 + T hücre Zenginleştirme Seti	Kök Hücre Teknolojileri	19052
EasySep İnsan Belleği CD4 + T hücre Zenginleştirme Seti	Kök Hücre Teknolojileri	19157
EasySep İnsan naif CD4 + T hücre Zenginleştirme Seti	Kök Hücre Teknolojileri	19155
Big Easy EasySep Magnet	Kök Hücre Teknolojileri	18001	Gümüş
5 ml'lik tabanı yuvarlak bir polistiren Tüpler	BD Falcon	352008
15 ml polipropilen santrifüj tüpünde	VWR	89004-368
14 mL Polipropilen Yuvarlak Alt Tüpler	BD Falcon	352059
50 ml polipropilen santrifüj tüpünde	VWR	89004-364
İnsan anti-CD3 antikoru	Bio X Hücre	BE0001-2	Klonlama: OKT3
24 Well Polistiren Kültür Plakalı	BD Falcon	353047
96 Şey Yuvarlak Alt Doku Kültürü Plakalı	Grenier Bio-One	650180
Glutamax-I ve HEPES tamponu ile RPMI 1640	Gibco	72400
Fetal bovin serumu (FBS)	Gibco	16000
β-merkaptoetanol	Sigma	M7522
TGF-β1 Rekombinant İnsan	eBioscience	14-8348-62
Rekombinant İnsan IL-2	eBioscience	14-8029-63
Bovine Serum Albumin (BSA)	MP Biomedicals Inc	810531
0.5 M EDTA	Amresco	E177
Fare anti-insan CD25-PE	Miltenyi Biotec	130-091-024	Klonlama: 4E3
Fare anti-insan CD45RA-PE-Cy5	eBioscience	15-0458-42	Klonlama: HI100
Fare anti-insan CD127-APC	Miltenyi Biotec	130-094-890	Klonlama: MB15-18C9
DNaz II	MP Biomedicals Inc	190370
MoFlo Akış Sitometresi	Beckman Coulter
FlowJo Yazılım	Ağaç Yıldız, Inc
Hücre Görev Pro Yazılımı	BD Biosciences
Yenidoğan Buzağı Serumu	Gibco	16010
L-glutamin	Gibco	25030
AIM-V	Gibco	0870112
CellTrace KAKE Hücre Çoğalması Kiti	Invitrogen	C34554
Bastırma Müfettiş Boncuk Treg	Miltenyi Biotec	130-092-909
Penisilin-Streptomisin	Gibco	15140
40 uM Naylon Hücre Gerginliker	BD Falcon	352340