Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu

1. Beyin Homojenat ve Deterjan-Çözünür (S2) ve çözünemeyen (P2), fraksiyonlar hazırlanması

1. 100 mg insan dondurulmuş beyin dokusu almak ve (10 mM Tris, 150 mM NaCl,% 0.5 Nonidet P-40 (NP-40),% 0.5 EDTA, pH 7.4) 100 ul lizis tamponu ilave edin.
2. Bir akülü motor tarafından tahrik havaneli kullanarak buz üzerinde homojenize, bu da 20 olan 5 dk için kuru buz içinde dondurmak ve motor tarafından ilk ve sonra eller tarafından tahrik havaneli kullanarak tekrar homojenize ve 300 ul veya 800 ul lizis tamponu (ekleyin % veya 10% toplam beyin homojenat, sırasıyla).
3. 4. 10 dakika ° C benchtop santrifüj kullanarak süpernatant (S1) toplamak için 1000 xg'de% 20 veya% 10 toplam beyin homojenat santrifüjleyin.
4. 4 ° C'de 1 saat boyunca bir SW55 rotor içinde 35,000 rpm (100,000 xg) (Beckman Coulter, Fullerton, CA)% 10 S1 Ultrasantrifüj Temiz bir tüp içine deterjan çözünebilen fraksiyonu içeren süpernatan (S2) aktarın. Çözünmeyen deterjan içeren granül süspanseya da 5-kat konsantre hazırlama - 100 ul ya da 10 yapmak için 200 ul lizis tamponu içinde fraksiyonu (P2).
5. PK-sindirim, S2 ve P2 fraksiyonların her ikisi için de, 1 saat boyunca 37 ° C 'de 50 ug / ml' de PK aynı miktarda örnek inkübe edilir. 5 mM ve PK sindirim sonlandırmak için SDS numune tamponu (% 3 SDS, 2 mM EDTA,% 4 β-merkaptoetanol,% 10 gliserol, 50 mM Tris, pH 6,8) ve eşit hacimde son konsantrasyon phenylmethylsulfonyl fluorür ekleyin. 10 dakika için kaynatılır ve numuneler 5 dakika için oda sıcaklığında soğumasına onları. Onlar Western blot için hazırız.

2. Sukroz Adım Degradeler Hız ve Sedimantasyon

1. Buz üzerinde 30 dakika için _H2O içinde% 2 sarkosyl eşit bir hacim ile 450 ul% 20 S1 inkübe edin.
2. 0.5 ml% 60 her biri,% 30,% 25,% 20,% 15, ve en fazla 5 ml kapasiteli bir Beckman tüp içine% 10 sakaroz ekleyin.
3. 10-60% sakaroz adım degradelerin üstüne S1 0.4 ml yükleyin.
4. 4 santrifüjleyin4, 1 saat boyunca 8000 rpm (200,000 xg, SW55 rotor), ° C.
5. Her tüpün üst 283 ul fraksiyonu toplayın ve toplam 12 fraksiyon elde.
6. Yeni bir Eppendorf tüpüne her bir fraksiyon 20 ul al, 10 dakika boyunca 20 ul örnek bir tampon, ve kaynatılır.
7. Kaputu 4 dakika Serin örnekleri, 1 dk ve vorteks onlar için 1.000 xg santrifüj. Bir ön döküm jel üzerine örnekleri yerleştirin.

3. Boyut Dışlama Kromatografisi

1. PrP moleküllerin oligomerik durumunu belirlemek için bir 1 x 30 cm sütun Superdex 200 HR boncukları (Pharmacia, Uppsala, İsveç) kullanın.
2. Albümin Dekstran mavi (2.000 kDa), tiroglobulin (669 kDa), apoferritin (443 kDa), β-amilaz (200 kDa), alkol dehidrogenaz (150 kDa), dahil olmak üzere yedi moleküler kütle belirteçleri (Sigma, St Louis, MI) ( 66 kDa), karbonik anhidraz (29 kDa) 200 ul numune hacimlerindeki Sigma tarafından tavsiye edilen konsantrasyonlarda bağımsız olarak yüklenir.
3. Mavi Dext elusyon hacminderan ürün komutu tarafından sağlanan boşluk hacmi (V ₀ = 8.45 ml) ve toplam hacmi (V _t = 24 ml) belirlemek için kullanılır. Pik elüsyon hacmi (V _e) ve kromatogram fraksiyonel kestiği hesaplanır. - / (V _t - V ₀₎ K _av = (V ₀ V _e): K _av, dağılım katsayısı (örnek davranışını tanımlayan), denklem kullanılarak hesaplanır. Kalibrasyon eğrisi standartları ⁸ günlük MW karşı protein standartlarının K _av çizerek belirlenir.
4. Farklı FPLC fraksiyonları ele çeşitli PrP türlerin molekül ağırlığı (MW) çeşitli standartları jel filtrasyon ile oluşturulan bir kalibrasyon eğrisine göre değerlendirilir.
5. Her çalışma için sütuna 1% sarkosyl içeren lizis tamponu 200 ul S1 enjekte.
6. Kromatografi 0.25 ml / dk ve fraksiyonunun bir akış hızında, bir FPLC sistemi (GE Healthcare) içinde gerçekleştirilirin 0.25 ml 'lik her bir fraksiyon toplayıcısı (Amersham Biosciences, RediFrac) kullanılarak toplanmıştır.
7. 2 saat boyunca -20 ° C'de 0.5 ml önceden soğutulmuş metanol ile 0.125 mL, her fraksiyonda inkübe edin.
8. 4. 30 dakika ° C benchtop mikrosantrifüj en çok 13.000 xg'de santrifüjleyin. Süpernatant atılır, oda sıcaklığına kadar soğutulur 10 dakika için kaynar, yukarıda da belirtildiği gibi 20 ul SDS numune tamponu içinde tekrar süspansiyon pelet, bir ön-dökme jel üzerine yerleştirin.

4. G5p tarafından PrP Capture

1. G5p molekülü (100 mikrogram) (nazik Portsmouth, UK Üniversitesi'nden Dr. Geoff Kneale ve John McGeehan tarafından sağlanan) 7 konjuge x 10 ⁸ tosil 1 ml 100 mikrogram G5p ve 350 ul G5p boncuk inkübe ederek manyetik boncuk aktive 20 saat süre ile 37 ° C 'de bir fosfat-tamponlu salin (PBS). Dış manyetik kuvvet tarafından Eppendorf tüpleri yan duvarına G5p-boncuk çekin ve sonra tüm çözüm çıkarın. 1 ml PBS içeren boncuklar ile yıkayın% 0.1 sığır üç defa için albümin (BSA) serum.
2. Spesifik olmayan bağlanma engellemek için 5 saat için 0.2 M Tris-HCI, 37% 0.1 BSA ihtiva eden pH 7.4 '° C'de 1 ml G5p boncuk ile konjuge inkübe ve sonra PBS içinde 1 ml% 0.1 BSA ihtiva eden boncuk ile yıkayın üç kez yukarıda da belirtildiği gibi. Çözüm çıkarın ve boncuklar içine PBS 1 ml ekleyin. Hazırlanan G5p boncuklar 4 ° C 'de en azından 3 ay boyunca stabil
3. G5p ile PrP yakalama bağlayıcı tampon, 1 ml 60 ul G5p konjuge boncuklar (10 ug protein / 6 x 10 ⁷ boncuk) (% 3 Tween 20,% 3 NP-S1 ile 100 ul fraksiyon ya da P2 inkübe edilmesiyle gerçekleştirilir PBS, pH 7.5 'te 40).
4. Oda sıcaklığında 3 saat boyunca sabit dönüş ile inkübasyondan sonra, PrP-içeren G5p boncuk çözeltisi içinde çözülmüş bütün moleküller kolayca çıkarılmasına izin veren, harici bir manyetik kuvvet ile Eppendorf tüpleri yan duvarına karşı çekilir.
5. Yıkama tamponu ile üç yıkama (% 2 Tween-20 ve PBS içinde% 2 NP-40, pH 7 takiben.5), G5p boncuklar 95 toplanır ve ısıtılır SDS numune tamponu içinde 5 dakika (% 3 SDS, 2 mM EDTA,% 10 gliserol, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8) için ° C.
6. Oda sıcaklığında 5 dakika için örnekler soğutulduktan sonra, numuneler, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 1000 x g'de santrifüj edilir. Süpernatantlar Western blot için hazırız.

5. Western Blotting

1. Yük örnekleri ~ 80 dakika için 150 V az% 15 mM Tris-HCl, Ölçütleri önceden dökme için jeller (Bio-Rad) üzerine SDS numune tamponu içinde kaynatılır.
2. Jelleri üzerinde proteinleri 70V az 2 saat süreyle PVDF transfer edilir.
3. % 5 süt içinde bloke sonra zarlar Tris-tamponlu salin% 0.01 Tween-20 ihtiva eden (TBS-T), membranlar 1E4 (1, birincil monoklonal ya da poliklonal antikor 3F4 (1/40.000) ile oda sıcaklığında 2 saat süreyle inkübe edilmektedir : 1000), anti-N ⁸ (1:6,000), ya da anti-C PrP molekül tarama için ⁸ (1:6,000).
4. HRP-konjüge at koyun anti-fare IgG ile inkübasyon sonrasında1:3000, ya da eşek anti-tavşan IgG 1:3,000 da PrP bantları, imalatçının protokolüne göre, ECL Plus kullanılarak Kodak film üzerinde görüntülenmiştir.

6. Temsilcisi Sonuçlar

PrP ^C çoğu S2 fraksiyonu (Şekil 1) elde edildi rağmen Sporadik CJD'li numuneleri ile karşılaştırıldığında, iPrP ^{C sinin} küçük bir miktarı normal beyin içinde P2 fraksiyonunda saptanmıştır. Tam uzunlukta ve N-terminal olarak kısaltılır türler de dahil olmak üzere toplam PrP yaklaşık olarak% 5-25 için önceden ^8, iPrP hesaplar belirtildiği gibi.

Sukroz adım gradyanı sedimentasyon kullanarak Analizleri olmayan CJD beyninden PrP ^C çoğunu 1-3 üst kesirler ele iken, PrP küçük miktarlarda da normalde büyük agrega ⁸ (Şekil içeren alt fraksiyonları 9-11 saptandığını ortaya koydu 2).

PrP ^Sc türlerin çeşitli çaldımonomerlerden ing, daha büyük agregalar küçük oligomerler, Creutzfeldt-Jakob hastalığı (Şekil 3A) ile beyindeki jel filtrasyon ile izole edildi. Bununla birlikte, 2,000 kDa molekül ağırlığı daha yüksek olan büyük agrega küçük bir miktar, aynı zamanda, normal beyin çözünmeyen fraksiyon (Şekil 3C) olarak tespit edildi. Ayrıca, dimerleri ve PrP ^C tetramers yalnızca çözünmeyen fraksiyonlar hem de çözünebilir fraksiyon (Şekil 3B ve 3C) tespit edilememiştir.

PK ve PNGase tedaviden sonra, G5p tarafından yakalanan PrP PrP97-105 ⁸ karşı 1E4 antikoru ile tespit edildi. Üç PK dayanıklı çekirdek parçası olarak adlandırdığı PrP * ^20, PrP * ¹⁹ ve PrP * ⁷ sırasıyla ~ 20 kDa, ~ 19 kDa ve ~ 7 kDa (Şekil 4, sol panel) de göç, tespit edildi. 1E4 antikor bir sekans tanım olan bir sentetik peptid ile önceden inkübe edildi, ancak, herhangi bir PrP tespit1E4 ile tespit bantlar PrP parçası bulunmaktadır gösteren 1E4 epitopu (Şekil 4, orta panel) ile ical. Ayrıca, anti-C antikor ~ 18 kDa az iki farklı geçiş PrP fragmanları tespit (PrP * ¹⁸⁾ ve PrP ek olarak ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), * ²⁰ (Şekil 4, sağ panel).

Şekil 1. IPrP ^C ve iPrP ^Sc Algılama. 1 saat boyunca 37 ° C'de toplam reaksiyon hacmi 1/10 PNGase F ile tedaviden sonra protein, tam uzunluklu ya da N-terminal olarak (S2 ve P2) çözünür ve çözünür olmayan fraksiyonlarının PrP tür kesilmiş izole dan glukanlardır kaldırmak için normal kontrol (CTL) ve sporadik CJD (sCJD) beyin örneklerinde ultrasantrifiij ile PrP23-40 (orta panel) karşı PrP106-112 (sol panel), anti-N karşı 3F4 ile tespit edildi ve PrP karşı anti-C220-231 (sağ panel). Büyük miktarda S2 içinde mevcut iken, CTL örneklerde, PrP küçük bir miktar, P2 olarak tespit edilir. Buna karşılık, daha PrP sCJD örnekleri S2 daha P2 tespit edilir.

Şekil 2. Sükroz adım Degradelerde PrP sedimantasyon. 1 olmayan CJD beyin numunesini S1 11 bireysel kesirler PrP Batı 3F4 ile blot tespit edildi. PrP ^C çoğu 1-3 üst kesirler tespit edilmesine karşın, PrP küçük miktarlarda da dip kesirler 9-11 gözlendi. Ayrıca, üst ve alttan PrP bant deseni farklıdır: alt fraksiyonları ele PrP baskın alt band varken iyi kesirler ele PrP baskın bir üst bant vardır. A PK-tedavi PrP ^Sc leke sağ tarafında bir kontrol olarak yüklendi.

Şekil 3. Çözünür ve çözünmez PrP ^C oligomerlerinin Algılama. Normal insan beyninden çözünür ve çözünmez PrP ^C ultra-santrifüj ile ayrılır ve daha sonra, sırasıyla, jel filtrasyon tabi tutuldu. Bireysel fraksiyonların molekül boyutları moleküler ağırlığı bilinen bir grup çalışan ile ölçüldü. SCJD beyin numuneleri (A) PrP ^Sc türler. PrP türlerin iki nüfus tespit edilmiştir: jel filtrasyon fraksiyonu 49 - kesirler 27-33 büyük agrega içerir oysa 65, monomerler ve küçük oligomerler içerir. Normal kontrol çözünebilir fraksiyon (S2), (B) ve çözünmeyen bölüm (P2), (C) PrP ^C tür tespit edildi. PrP 3F4 antikoru ile sondajlanan edildi. Dimerleri (fraksiyon 55) ve PrP tetramerleri (fraksiyon 51), P2, aynı zamanda, normal beyin sampl S2 olarak değil, sadece tespit edildiES (B ve C). Büyük agregalar sadece normal örnekleri (C) P2 saptandı.

Şekil 4. Normal insan beyninden G5p zenginleştirilmiş hazırlıkları çeşitli PK dirençli iPrP fragmanlarının tespiti. G5p ile zenginleştirilmiş örnekleri Western (sol panel), 1E4 1E4 epitopu (orta panel) için özdeş bir sekans vardı bir sentetik peptid ile 1E4 önceden inkübe ile problama kurutma öncesinde PK ve PNGase F ile muamele edilmiş ve anti-C (edildi sağ panel). 1E4 üç PK dayanıklı PrP fragmanları adlandırdığı tespit PrP * ^20, PrP * ¹⁹ ve PrP * ⁷ (sol panel). Peptit ile 1E4 engelleme sonra, hiç PrP ^res 1E4 ile tespit bantları PrP parçaları olduğunu belirten, (orta panel) saptandı. Anti-C, iki yanı PK dayanıklı PrP fragmanları adlandırdığı ortaya PrP * ¹⁸ ve PrP-CTF12 /13, PrP * ²⁰ ek olarak.

Çıkar çatışması ilan etti.