Hücresel prion proteini yeni bir tür (PrP C) Son zamanlarda burada açıklanan yöntemleri kullanarak bulaşmamış insan beyni saptanmıştır. Bunların bazıları, aynı zamanda, insan beyninden diğer katlanan protein büyüklükler izole yararlıdırlar Bu yöntemler, çeşitli PrP tür izole etmek için de kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Normal İnsan Beyin Çözünür ve çözünmez PrP Oligomerleri İzolasyonu
Bu makalede
Özet
Özet
Prion hastalıklarının patogenezinde merkezi bir olay, onun patojenik izoformu PrP Sc 1 içine konak-kodlanmış hücresel prion proteini PrP C bir dönüşüm içerir. PrP-Sc deterjan çözünmez agregaları ve PK 2-6 karşı kısmen dirençlidir ise PrP C, deterjan çözünebilen ve proteinaz K (PK)-sindirim duyarlıdır. PrP Sc PrP C dönüştürme protein β-tabaka yapıları α-sarmal bir konformasyon geçiş dahil olduğu bilinmektedir. Ancak, in vivo yolu içinde çok az anlaşılmıştır. Bir geçici endojen PrP Sc, ara PrP * veya "sessiz prion", bulaşmamış beyin 7 tespit edilmesi henüz.
Biyofiziksel ve biyokimyasal yaklaşımların bir arada kullanarak, bulaşmamış memeli beyin ve nöronal kültürlü gelen çözünmez PrP C agrega (belirlenmiş iPrP C) tespithücreler 8, 9. Burada, deterjan tampon, sukroz adım degrade sedimantasyon, boyut dışlama kromatografisi, özellikle yapısal değişmiş PrP formları, 10 ve PK-tedavi bağlamak gen 5 proteini (G5p) tarafından iPrP zenginleşmesine Ultrasantrifügasyon dahil olmak üzere bu yöntemlerin ayrıntılı prosedürleri açıklar. Bu yaklaşımların birleşimi çözünmeyen PrP Sc ve PrP C büyüklükler değil, aynı zamanda normal insan beyninden çözünür PrP C oligomerler sadece ayırır. Protokolleri enfekte beyinleri ve enfekte olmayan beyninden iPrP C PrP Sc hem izole etmek için kullanılan oylandı Burada açıklanan bu yana, fizikokimyasal özellikleri, nörotoksisite ve iki izoformu arasındaki enfektivite farklılıkları karşılaştırmak için bir fırsat verin. Böyle bir çalışmanın büyük ölçüde bulaşıcı proteinli patojenlerin anlayışımızı geliştirecektir. IPrP C fizyolojisi ve patofizyolojisi halen belirsizdir. Özellikle, yeni-idyazısından İnsan prion hastalığı proteaz duyarlı prionopathy değişken olarak adlandırılan, biz iPrP C 11, 12 ile immunoreaktif davranış ve parçalanma paylaşan yeni PrP Sc bulundu. Ayrıca, biz son zamanlarda iPrP C Alzheimer hastalığı 13 amiloid-β proteini ile etkileşime ana tür olduğunu göstermiştir. Aynı çalışmada, bu yöntemlerin diğer nörodejeneratif bozukluklar ile ilgili olmayan prion proteininin agregalar için uygulama düşündüren, Alzheimer hastalığının 13 Abeta agrega ve oligomerler izole etmek için kullanılmıştır.
Protokol
1. Beyin Homojenat ve Deterjan-Çözünür (S2) ve çözünemeyen (P2), fraksiyonlar hazırlanması
- 100 mg insan dondurulmuş beyin dokusu almak ve (10 mM Tris, 150 mM NaCl,% 0.5 Nonidet P-40 (NP-40),% 0.5 EDTA, pH 7.4) 100 ul lizis tamponu ilave edin.
- Bir akülü motor tarafından tahrik havaneli kullanarak buz üzerinde homojenize, bu da 20 olan 5 dk için kuru buz içinde dondurmak ve motor tarafından ilk ve sonra eller tarafından tahrik havaneli kullanarak tekrar homojenize ve 300 ul veya 800 ul lizis tamponu (ekleyin % veya 10% toplam beyin homojenat, sırasıyla).
- 4. 10 dakika ° C benchtop santrifüj kullanarak süpernatant (S1) toplamak için 1000 xg....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada bildirilen yaklaşımların birleşimi normal insan beyninin sürekli çözünmez PrP C agrega ve çözünür PrP C oligomerler ayırır. Bir saat boyunca 100,000 x g'da santrifüjü gibi geniş ölçüde çözünür PrP C den 14 çözünmez PrP Sc ayrılması için kullanılmış olan klasik bir yöntemdir. Bu, uyarılar bir etkili olsa da santrifüj sonrasında (S2) süpernatant çekme sırasında kirlenmesini önlemek içindir. IPrP C jel profil PrP C bundan farklı olduğu .......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Çıkar çatışması ilan etti.
Teşekkürler
yazarlar normal beyin numuneleri sağlamak için İnsan Beyin ve Omurilik Sıvısı Kaynak Merkezi (Los Angeles, CA) müteşekkiriz. Bu çalışma McGregor Vakfı'nın desteği ve Cumhurbaşkanı İhtiyari Fonu (Case Western Reserve Üniversitesi) ile Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01NS062787, CJD Vakfı, İttifak BioSecure yanı sıra Üniversite Yaşlanma Merkezi ve Sağlık tarafından desteklenen .
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar (isteğe bağlı) |
| Phenylmethylsulfonyl florür | Sigma-Aldrich | P7626 | 2-propanol içinde 72 mM |
| Proteinaz K | Sigma-Aldrich | P2308 | H2O içinde 2 mg / ml |
| PNGase F | New England Biolabs | MWGF200 | |
| LE-80K, SW55 rotor ultrasantrifüjdeki | Beckman Coulter | Parça No 365668, 356860 | |
| Superdex 200 HR boncuk | GE Healthcare | 17-1088-01 | |
| AKTA FPLC sistemi | GE Healthcare | 18-1900-26 | |
| Molekül ağırlığı belirteçler | Sigma-Aldrich | MWGF200 | Çeşitlidir |
| Dynabeads M-280 manyetik boncuk | Invitrogen | 143-01 | |
| 3F4 antikoru | Covance | SIG-39600 | |
| Antikor 1E4 | Hücre Bilimleri | M1840 | |
| Hazır jel% 15 mM Tris-HCl, önceden dökme jeller | Bio-Rad | 345-0020 |
Kaynaklar
- Prusiner, S. B. Prions. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 13363-13383 (1998).
- Oesch, B., Westaway, D., Wälchli, M., McKinley, M. P., Kent, S. B. H., Aebersold, R., Barry, R. A., Tempst, P., Teplow, D. B., Hood, L. E., Prusiner, S. B., Weissmann, C. A cellular gene encodes scrapie PrP 27-30 protein. Cell. 40, 735-746 (1985)....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
