Kabuklu uzun vadeli Lethal Toksisite Testi Artemia Franciscana</em

Özet

Bu çalışmada, kimyasal maddeler, endüstriyel atık su veya kanalizasyon ve tuzlu kabuklu sıvı çevresel örneklerde tarafından uygulanan uzun vadeli (14 gün) ölümcül toksisite belirlemek için değerli bir metodolojik protokolünün geliştirilmesi ve standardizasyonu ile ilgilidir Artemia Franciscana.

Özet

Bizim araştırma faaliyetleri tuzlu / acı su ve tortu özel referans ile, çevre kalitesinin değerlendirilmesi için biyolojik yöntemlerin kullanılmasını hedefliyoruz. Biyolojik göstergelerin seçimi standart prosedürlerin kullanılabilirliği, muhtemelen, güvenilir bilimsel bilgiye dayalı ve olmalıdır. Bu yazıda, kimyasal ve / veya deniz çevresel matrislerin toksisitesini değerlendirmek için deniz kabuklu Artemia kullanılan standart bir protokol mevcut. Bilim adamları, tuzlu su karidesi (artemia) dünya çapında kullanım için standart biyoassay gelişimi için uygun bir aday olduğunu öneriyorum. Kağıtları bir dizi tuzlu su karidesi (artemia) çeşitli kimyasallar ve toksik maddelerin toksik etkileri üzerine yayınlanmıştır. Toksisite çalışmaları için bu canlıya en büyük avantajı, kuru kistler genel durumu ise; bu hemen test kullanılabilir ve zor ekimi talep edilmez 3, böylece toksisite tarama rutin ihtiyaçlarına önemli bir cevaptır. Önerilen yöntem, bir nokta olarak ölüm içerir. Hayatta kalanların numaraları sayıldı ve ölüm oranı hesaplandı. Gözlem ⁴ birkaç saniye içinde herhangi bir iç veya dış hareket sergilemek vermedi Larva ölü kabul edildi. Bu işlem bir referans madde (Sodyum dodesil sülfat) standart test idi; bazı sonuçlar bu çalışmada rapor edilmiştir. Bu makale, protokole ilgili tüm adımları gösteren, usul toksisite test performansını açıklayan bir video eşlik eder.

Protokol

1. Yöntem Standart

Bizim test organizmaların% 50 ölüm (LC ₅₀₎ 14 gün boyunca maruz neden olacak konsantrasyonu veya seyreltme düzeylerini belirlemek amacıyla madde konsantrasyonları bir aralık veya bir test örneği için Artemia larvaları teşhir ve belirlenen şartlar içerir Bu yöntem. Gerekli ve mümkün olursa, şu da tespit edilebilir: a) maruz kalan organizmaların% 20 (LC ₂₀₎ ölümüne sebep konsantrasyon seviyesi, b) daha yüksek bir ölüm oranı belirlemek değil, en yüksek analiz konsantrasyon seviyesi Negatif kontrol (NOEC); 14 gün, negatif kontrol (LOEC) daha yüksek bir ölüm oranı sonra, belirler düşük seviyede test edilen konsantrasyon.

2. Test Malzeme

2.1 Artemia yumurtaları

Testi gerçekleştirmek için, Artemia Franciscana larvaları (nauplii) yeni yumurtadan yumurta ⁵ elde, evre II ve III de gereklidir. Test desteklemek için kullanılan Sertifikalı yumurta veya kistler, Kalite Güvence Araştırma Bölümü, ABD Çevre Koruma Ajansı, Cincinnati, OH 45268, USA veya Su Kirliliğinin Biyolojik Araştırmalar, Ghent Üniversitesi, Belçika Laboratuvar örneğin ticari olarak kullanılabilir.

2.2 Su seyreltme

Sentetik tuzlu kabul analitik kalite reaktifler veya distile veya deiyonize su içinde ticari olarak satılan bir formülasyon çözülmesiyle hazırlanmıştır, seyreltme suyu olarak kullanılabilir. İdeal tuzlu oluşturmak için tuz karışımlarının, ticari olarak mevcuttur, örneğin Instant Ocean karışımları. Bu, 35 (± 2) eşit olan bir tuz ile seyreltme su tavsiye edilir PSU yanı sıra doymuş değerin% 80'den fazla bir çözünen oksijen konsantrasyonuna ve 25 arasında bir sıcaklıkta (± 2) vedeg C. 48 saat ve en azından 0.45 mikron bir gözenek ile filtre filtrelenmesi için havalandırma sonra, seyreltme 0-4 ° C'lik bir sıcaklıkta karanlıkta 30 gün arasında bir maksimum saklanabilir

2.3 Alg kültürü

2.0x10 ⁶ hücre / ml - Bu test organizmaları katlanarak artacak ve 1.3x10 ⁶ yoğunlukları ulaşmak Dunaliella tertiolecta mikroalg, yem, olduğunu önerilir. Çevresel numuneler üzerinde test 2.0x10 ⁶ hücre / ml ⁶ daha yüksek yoğunluklarda kültür gerektirir. Bu Dunaliella tertiolecta deniz suyu içeren bir kültür ortamında yetişen ileri sürülmektedir (30 (± 2) PSU ve 20 (± 1) ° C) temel besin, mineral ve vitamin ilavesi ile. Alg medya oluşumu ve hazırlık ilişkin bazı göstergeler Ek bildirilmektedir. İlk hücre yoğunluğu yaklaşık 10 ⁵ hücre / ml olması tavsiye edilir. Alg kültür saklanır20 oda termostatı (± 1) ° C, karanlığın 8 saat ışık 16 saatlik bir periyodu oranı ile floresan lambalar 3000 (± 300) lx ile aydınlatılmıştır.

Diğer fitoplankton türlerinin de beslenme için kullanılan olabilir ama Dunaliella tertiolecta için "eşdeğer" türler bulmak için bu fitoplankton türleri ile karşılaştırmalı çalışmalar yapmak için gerekli olacaktır, çünkü deneysel koşullar (örn. başlangıç ​​hücresi yoğunlukları, ışık aydınlatma, sıcaklık, bileşimi kültür ortamı ve maruz kalma süresi) fitoplankton türleri arasında değişir. Farklı kirleticiler için microalglerin tolerans düşünülmesi gereken yanı sıra, çünkü aynı zamanda Artemia için fitoplankton etki büyüme ve gelişme üzerindeki kirletici etkileri.

2.4 Referans madde

Bu testte referans madde sodyum dodesil sülfat olduğunu.

2.5 Laboratuar cam

, aşağıdaki malzeme gereklidir:

1. 100 ml borosilikat cam bardak (18 çözümler aktarılması için test ve 18 gerçekleştirmek için) dahil test kaplar.
2. Standart çözelti hazırlamak için bir şişesi (örneğin 500 ml bir şişede).
3. Test çözümleri hazırlamak için altı matara (örneğin 200 ml şişeler).
4. Çıkarılabilir ile cam veya polistiren 5 cm çapında Petri kutularına kistler aktive ve test kaplara kuluçka çanağına Artemia aktarılması için kullanılmak üzere kapsar.
5. Nauplii aktarmak için Cam Pasteur pipetler (alev yuvarlak uçları ile).
6. Cam kanüller ve Artemia aktarmak için Pasteur 3 ml tek kullanımlık plastik pipetler (kesilecek).
7. Mikropipetler ve dereceli pipetler test çözümleri hazırlamak.
8. T matara gelen test çözümleri aktarmak için Altı dereceli silindir (örneğin 50 ml silindirler)O konteyner test.

3. Kist Etkinleştirme

3.1. Kistleri içeren Petri + su dökerek

Test organizmalar üretmek için, kistler, 20 mg 48 saat testten önce seyreltme suyun 12 ml içeren bir Petri tabağına yerleştirilir.

3.2. Işık ve karanlık Kuluçka

Petri (± 2) 25 tutulur ° C ve 4000 (± 1000) lüks (metre kare başına lümen) bir saat boyunca ışık şiddeti az.

3.3. Mikroskobu kullanılarak orta değiştirilmesi

24 saat sonra, kuluçka larva yapay su ile doldurulur, yeni bir Petri tabağı içine aktarılır. Transferi kuluçkalık, phototropic larvaları ışık demeti doğru göç böylece yani bir ışık kaynağı kullanarak, mikroskop kullanılarak yapılır. Bir cam Pasteur pipeti sadece olgunlaşmamış larvaların ar sağlanması, transferi yapmak için kullanılıre membranlar hala kist ya da larva transfer değil.

3.4. Karanlıkta Kuluçka

Larvalar içeren çanağı 25 C'de 24 saat karanlık termostatik haznesi yerleştirilir (± 2) ° C.

4. Test Çözümleri hazırlanması

4.1. Madde Tartı + şişesi transfer

Bu test madde için standart çözelti bir 500 ml'lik şişe içinde madde 0.5 g çözülmesi ile hazırlanır tavsiye edilir. Şişeye de-iyonize edilmiş su veya distile su ile doldurulur ve test madde tamamen eriyene kadar çözelti karıştırılır. Çözümlerin bu maddenin çözelti içinde stabil olup olmadığı bilinmemektedir sürece, kullanım sırasında hazırlanması gerekmektedir. Bu durumda, standart bir test çözeltisi iki gün önce kadar hazırlanabilir.

4.2. Seyreltme suyu ve yosun wi ekleyerek, negatif kontrol hazırlanması10 ml pipetle th

Negatif kontrol 10 ⁵ hücre / ml 'lik bir yoğunluğa elde edilir, böylece su ile seyreltme alg süspansiyonu bir alikot eklenerek bir şişesi (örneğin 200 ml hacim) içinde hazırlanır.

4.3. Test çözümleri Hazırlanması: seyreltme suyu, yosun ve standart çözüm ekleyerek

Bu test çözümleri testleri için istenilen konsantrasyonu elde edilir, böylece belirtilen miktarlarda su ile seyreltme, standart çözeltisinin eklenmesi ile beş 200 ml'lik şişeler içerisinde hazırlanır ileri sürülmektedir. Organizmaların beslemek için bir Dunaliella tertiolecta mikroalg süspansiyon alikotları kullanılır ve test çözümleri hazırlanır olduğunda 10 ⁵ hücre / ml bir yoğunluğa ulaşmak için ilave edilebilir. Ek aşağıdaki sırayla önerilir: seyreltme suyu, alg süspansiyon ve standart çözüm. Test çözeltilerinin hazırlanması sonra, kısa sürede ölçüm içinde kullanılabilir olması gerekir.

4.4. Sonra Petri kutuları için, şişesi test kapları çözümler aktarma

Test çözümleri eşit miktarlarda (50 ml) oldu silindir kullanılarak test kaplar içine tanıtılır. Her bir konsantrasyonu için üç kopyaları yapılır. Testler, her seri için, bir kontrol testi kabın çözeltilerinin hacmine eşit bir seyreltme bir miktar su ile hazırlanır. Test solüsyonları eşit hacimleri (12 ml) Petri kutularına sisteme dahil edilir. Testler, her seri için, bir kontrol Petri tabağı kullanılır.

5.. Test için hazırlık

5.1. II-III aşamasında nauplii

Kist aktif hale kırk sekiz saat, nauplii II-III larva ulaşmak ve test için daha sonra kullanabiliyorsunuz.

5.2. Mikroskop kullanılarak Petri içine nauplii transferi

Kist için kullanılan petri aktivasyon termostatik odasının dışına alınır. Larva küçük bir miktar kontrol ve test çözümleri içeren Petri aktarılır. Bu görev organizmaların zarar kalmamak için yeterince geniş çaplı bir pipet kullanılarak mikroskop ile gerçekleştirilen olmaktır. Test Bu aşamada, transferi bir cam Pasteur pipeti (alev yuvarlak uçlu) ve agrega için Artemia teşvik eden bir yanal olarak yerleştirilmiş ışık kaynağı ile yapılabilir.

5.3. Mikroskop ile test kaplara Petri gelen nauplii transferi

On larvaları test kaplara test çözümleri Petri kutularına aktarılır. Ayrıca, bu işlem Pasteur pipet ve mikroskop kullanılarak yapılmalıdır. Bu, 1 mL aşmayan bir hacim test sisteminin genel hacmi etkilemediği larvaların geçiş sırasında transfer edilmesi tavsiye edilir.

e_step "> 5.4. Tam konteyner parafilm kaplı

Test bardak parafilm (hava geçişi için bir boşluk bırakarak) ile kaplı, ve 25 bir sıcaklık (± 2) ° C testi tüm süresi ve 900 (± 100) lx bir aydınlatma bir periyodu ile de korunur karanlığın 10 saat ışık 14 saat arasındaki orandır.

6. Orta ve Gıda Takviyesi Değiştirilmesi

6.1. Yaşama oranı kontrolü

Test başladıktan iki gün sonra, ve daha sonra 5, 7, 9 ve 12 gün sonra, Artemia hayatta kalma oranı doğrulamak için ve orta ve gıda ek yerine mikroskop altında görülmektedir.

Canlı organizmaların sayısı her test konteyner sayılır. Mikroskop altında gözlem ve hafif mekanik stimülasyonu (örneğin bir cam Pasteur pipeti ile larva dokunmadan) yaklaşık 10 s için bazı hareket görünmüyor organizmalar sonrasaniye basılı tutun ölü düşünülmelidir.

6.2. Mikropipet ile test edilecek maddenin bir 10 ml pipet ve örnekleme ile yosun örnekleme gösteren bir test solüsyonu hazırlanması. Şişesi test kapları çözümler aktarma

Test sırasında, test çözümleri periyodik olarak değiştirilmesi ve bunlar kullanılacaksa aynı gün içinde hazır olmalıdır. Test solüsyonları, önceden hazırlanmış standart bir çözüm yapılır.

Üç yeni konteyner eski testi kapları 6.3. Artemia transferi, bir kesim Pasteur pipeti kullanarak,

Artemia'nın transferi şekilde organizmalar zarar vermemek için yeterince geniş bir çapa sahip bir pipet kullanılarak gerçekleştirilir. Bu faz esnasında, bir 3 ml plastik Pasteur pipetle (kesilecek) kullanılabilir.

6.4. Ya canlı ya da ölü Artemia içeren bir cam kapta Larva

1 sonra Test sonunda maruz kalma 4 gün, larvaların hayatta kalma sayısı sayılır ve çalışma kaydedilir. LC ₅₀ ve / veya LC _20, NOEC ve 14. günlerde LOEC, hesaplanır ve kaydedilir, yanı sıra güven aralığı% 95, uygun ve hesaplama yöntemleri de.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Testi (14 gün) sonunda, aşağıdaki formüle göre, her bir konsantrasyonda ölüm yüzdesi hesaplanır:

(M _s / N) * 100

Nerede:

M _s analiz örnek ölen kişilerin ortalama sayısı

N maruz kalan bireylerin toplam sayısı

Tablo 1 Sodyum dodesil sülfat maruz Artemia ile bir test (14d) veri bir örnektir.

"Her çoğaltma ölen bireylerin> Numara

Konsantrasyonlar (mg / l)	Mortalite (%)
	Ben	II	III
Negatif kontrol	0	2	1	10
1.56	1	2	0	10
3.12	2	0	2	13
6.25	3	2	3	27
12.5	8	9	10	90
25.0	10	10	10	100
50.0	10	10	10	100

Dahası, belirlemekGrafiksel bir Gauss logaritmik arsa veya uygun istatistiksel yöntemler (örneğin Spearman-Karber veya Probit Yöntemi için) kullanılarak LC ₅₀ değeri. Tablo 1 ve veriler için LC ₅₀ hesaplanması 8,18 (7,15-9,37) mg / l'dir. Maksimum konsantrasyon% 50 daha düşük bir ölüm oranı neden Sınanan varsa, o güvenilmez, hatta olmayan hesaplanabilir olurdu LC ₅₀ değeri hesaplamasına devam etmemelisiniz. Bu durumda, bununla birlikte, test edilen konsantrasyon aralığı genişleterek testi tekrarlamak üzere uygun olacaktır. Alternatif olarak, LC ₅₀ değeri daha doğru bir olasılıkla test edilen en yüksek konsantrasyonda ölüm oranı ve bir etkisi yoktur karşılık gelen yüksek konsantrasyon gösteren, test edilen en yüksek konsantrasyonda daha büyük olarak ifade edilir.

Aşağıdaki test koşulları sonunda yerine getirildiği takdirde Sonuçlar geçerli kabul edilir:

1. kontrolü ortalama mortalite oranı≤% 20;
2. 14 gün için sodyum dodesil sülfat, LC ₅₀ kullanılarak 8.0 (± 5) mg / l aralığında yer alır burada.

Yukarıdaki şartlar yerine getirilmiş değil, organizmaların aynı parti ile elde edilen tüm veriler geçersiz kabul ve test tekrarlanmalıdır.

Tartışma

Artemia bize Toksikoloji ve Ekotoksikoloji içinde Artemia kullanımı ile ilgili çeşitli seçenekler sürdürmek mümkün olduğunu ifade sağlar şimdiye kadar yapılan ecotoxıcıty test ve araştırma için mevcut en değerli test organizmaları biridir. Biyoanalizlerin için uygun bir tür olarak bu organizmanın açmak özellikleri şunlardır: Geniş bir coğrafi dağılımı, olumsuz çevre koşulları ve çeşitli besin maddeleri, nispeten basit laboratuvar kültür ve bakım, manipülasyona karşı direnç, kısa yaşam döngüsü, büyük ya...

Malzemeler

Çevre koruma ve araştırma enstitüsünün Loredana Manfra (Çevre Kalitesi İzleme ISPRA-Bölümü) ve Çevre Koruma Bölge Ajansı (Emilia-Romagna, İtalya) Federica Savorelli tarafından hazırlanmıştır.

Tuzlu su / Kuyu Suyu ve UNICHIM Komisyonu Su Kalitesi (kimya sektöründe teknik standardizasyon çalışma için enstitusu) Tortu - Biyolojik Yöntemler Grubu içinde Artemia kabuklu üzerine alt çalışma grubu için referans Üyeleri.

ISPRA (Bilimsel Danışma ve Dokümantasyon Hizmetleri) Marco Pisapia tarafından Videography ve düzenleme.

Anna Maria Cicero ve ISPRA Erika Magaletti (Çevre Kalitesi İzleme Bölümü) tarafından Üretim Koordinasyonu.

Biz, Emilia-Romagna Çevre Koruma Bölge Ajansı teşekkür Ferrara Şubesi ve Biolog istiyorumical Yöntemleri Grubu - Tuzlu / Kuyu Suyu ve onların işbirliği için Su Kalitesi Üzerine UNICHIM Komisyonu Tortu; Rossella Boscolo ve mali destek için ISPRA Massimo Gabellini (Önlenmesi ve Etkilerinin Azaltılması Bölümü) ve Roma'da Diller London School of kendi dil desteği.

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Ürün numarası
Sodyum dodesil sülfat	Sigma-Aldrich	L4390

Ek

Alg medya analitik kalite reaktifler kullanılarak hazırlanmalıdır.

Besin solüsyonu bir litre NaNO _3, damıtılmış su içinde _NH4CI ile KH ₂ PO ₄ ve 20 g, 30 g, 300 g çözülerek hazırlanır.

Dört başlangıç ​​çözümleri (A, B, C, DMineral) şu şekilde hazırlanır:

• Çözeltisi bir litre "A" CuSO ₄ ZnSO _{4 H2O,} 25 g 5 _H2O, COSO ₄ 7 _H2O ile 30 g saf su içinde MnSO _{4 H2O} ile 20 g, 30 g ihtiva eden;
• Çözeltisi bir litre damıtık su içerisinde FeCl ₃ • 6 _H2O ile 50 g içeren "B";
• Çözeltisi bir litre damıtık su içerisinde ₂ Na Moo ₄ • 2 _H2O ile 25 g içeren "C";
• Çözeltisi distile su içinde 50 g di Na ₂ EDTA • 2 H ₂ O içeren "D" Bir litre.

Minerallerin (solüsyonu "E") bir nihai çözelti bir litre damıtık su ile yukarıda bahsedilen çözeltilerinin alikotları ekleyerek elde edilir. Ayrıca, aşağıdaki için tavsiye edilir: solüsyonu "D", 100 ml, çözelti 10 ml "C", çözelti "B" ve 10 ml ve 10 ml çözelti, "A".

Üç inisiyatifvitaminler l çözeltileri (F, G, H) şu şekilde hazırlanır:

• Çözeltisi bir litre damıtık su içerisinde biotin 100 mg içeren "F";
• ; Distile su içinde tiamin 10 g içeren çözelti "G" nin bir litre
• Çözeltisi distile su içinde kobalamin 100 mg içeren "H" bir litre.

Vitaminler (solüsyonu "I") bir nihai çözelti bir litre damıtık su ile üç başlangıç ​​çözeltilerinin 10 ml ekleyerek elde edilir.

Alg bir ortam litrelik besin solüsyonu, mineral nihai çözelti (solüsyonu "E") ve deniz suyu vitamin nihai çözelti (solüsyonu "I") ve 1 ml 1 ml 1 ml çözülmesiyle hazırlanmıştır. Bu ikinci kabul analitik kalite reaktifler veya distile veya deiyonize su içinde ticari olarak satılan bir formülasyon çözülmesi ile elde edilebilir. İdeal tuzlu oluşturmak için tuz karışımlarının, ticari olarak mevcuttur, örneğin Instant Ocean karışımları. Ülkemizde yapılan bir30 tuzluluk (± 2) PSU ve 20 sıcaklık (± 1) ° C ile deniz suyu kullanarak ded