Kompleks Örnekleri spesifik protein Glikozilasyon arasında Multiplexed Yüksek verim Profilleme için Kimyasal-bloke Antikor Mikroarray

Summary

Bu çalışmada, özel proteinlerin glikozilasyon profil kullanılabilir lektin saptama yöntemi ile çoklanır yüksek verim antikoru mikroarray için geliştirilmiş bir protokol açıklanmaktadır. Bu protokol, yeni, güvenilir reaktif özellikleri ve önemli ölçüde daha önceki prosedüre göre zaman, maliyet ve laboratuar ekipmanları gereksinimlerini azaltır.

Abstract

Bu çalışmada, spesifik proteinlerin glikozilasyon profillemesine izin veren glikan bağlayıcı protein tespiti ile çoğullanmış yüksek verimli bir antikor mikrodizisinde kullanım için etkili bir protokol tanımlanmıştır. Proteinlerin glikozilasyonu, proteinler üzerinde bulunan en yaygın translasyon sonrası modifikasyondur ve proteinlerin fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerinin çeşitlendirilmiş modifikasyonlarına yol açar. Glikozilasyon mekanizması, hastalığın ilerlemesine ve malign transformasyona özellikle duyarlı olduğundan, anormal glikozilasyon, kanser ve diğer hastalıklar için erken tespit biyobelirteçleri olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, protein glikozilasyonunu incelemek için mevcut yöntemler tipik olarak çoğu normal laboratuvar veya klinik ortamda kullanım için çok karmaşık veya pahalıdır ve protein glikozilasyonunu incelemek için daha pratik bir yönteme ihtiyaç vardır. Bu çalışmada açıklanan yeni protokol, glikan bağlayıcı protein (GBP) tespiti ile kimyasal olarak bloke edilmiş bir antikor mikrodizisinden yararlanır ve protein glikozilasyonunu incelemek için gereken zamanı, maliyeti ve laboratuvar ekipmanı gereksinimlerini önemli ölçüde azaltır. Bu yöntemde, çoklu immobilize edilmiş glikoproteine özgü antikorlar doğrudan mikroarray slaytları üzerine basılır ve antikorlar üzerindeki N-glikanlar bloke edilir. Bloke edilmiş, hareketsizleştirilmiş glikoproteine özgü antikorlar, doğrudan mikrodizi slaytlarına uygulanan karmaşık bir numuneden glikoproteinleri yakalayabilir ve izole edebilir. Glikan tespiti daha sonra biyotinile lektinlerin ve diğer GBP'lerin mikrodizi slaytına uygulanmasıyla gerçekleştirilebilirken, bağlanma seviyeleri Dylight 549-Streptavidin kullanılarak belirlenebilir. Bir antikor panelinin kullanılması ve çoklu biyotinile lektinlerle sondalama yoluyla, bu yöntem, belirli bir insan veya hayvan örneğinde bulunan farklı proteinlerin etkili bir glikosilasyon profilinin geliştirilmesine izin verir.

Giriş

Proteinler üzerinde en yaygın translasyon sonrası modifikasyon olan proteinin glikosilasyonu, bir proteinin fiziksel, kimyasal ve biyolojik özelliklerini değiştirir ve çeşitli biyolojik süreçlerde temel bir rol oynar^1-6. Glikozilasyon mekanizması hastalığın ilerlemesine ve malign transformasyona özellikle duyarlı olduğundan, anormal glikozilasyon, kanser ve diğer hastalıklar için erken tespit biyobelirteçleri olarak kabul edilmiştir ^7-12. Aslında, hepatoselüler karsinom ^13-15 için α-1 fetoproteinin (AFP) L3 fraksiyonu ve pankreas kanseri ^{16, 17} için CA199 gibi mevcut kanser biyobelirteçlerinin çoğu, glikoproteinler üzerindeki anormal glikan kısımlarıdır. Bununla birlikte, protein glikozilasyonunu incelemek için yöntemler karmaşıktır ve rutin laboratuvar ve klinik ortamlar için uygun değildir. Chen ve ark. yakın zamanda, karmaşık bir numune ^18'de doğal glikoproteinlerin yüksek verimli ve çoğullanmış profil glikosilasyonu için bir glikan bağlayıcı protein (GBP) tespit yöntemi ile kimyasal olarak bloke edilmiş bir antikor mikrodizisi icat etti. Bu afiniteye dayalı mikrodizi yönteminde, çoklu immobilize edilmiş glikoproteine özgü antikorlar, glikoproteinleri doğrudan mikrodizi lamı üzerindeki karmaşık karışımdan yakalar ve izole eder ve yakalanan her bir protein üzerindeki glikanlar GBP'ler ile ölçülür. Tüm normal antikorlar, çoğu GBP tarafından tanınabilen N-glikanlar içerdiğinden, bu yöntemin kritik adımı, antikorlar üzerindeki glikanların GBP'ye bağlanmasını kimyasal olarak bloke etmektir. Prosedürde, antikorlar üzerindeki glikanların ci s-diol grupları önce ışıktan kaçınarak sodyum asetat tamponunda NaIO₄ kullanılarak aldehit gruplarına oksitlendi. Aldehit grupları daha sonra bir çapraz bağlayıcı olan 4- (4-N-MaleimidoFenil) bütirik asit Hidrazid HCl'nin (MPBH) hidrazid grubuna konjuge edildi, ardından bir dipeptit olan Cys-Gly'nin MPBH'nin maleimid grubuna konjugasyonu yapıldı. Böylece, antikorların glikanları üzerindeki cis-diol grupları, lektinlerin ve diğer GBP'lerin yakalama antikorlarına bağlanmasını engelleyen hacimli hidroksil gruplarına dönüştürüldü. Bu bloke etme prosedürü, GBP'lerin ve lektinlerin yalnızca yakalanan proteinlerin glikanlarına bağlanmasını sağlar. Bu kimyasal blokajdan sonra, serum örnekleri antikor mikrodizisi ile inkübe edildi, ardından farklı biyotinile lektinler ve GBP'ler kullanılarak glikanlar tespit edildi ve Cy3-streptavidin ile görselleştirildi. Bir antikor panelinin ve çoklu lektin sondalamasının paralel kullanımı, belirli bir numune ^18-20'deki çoklu proteinlerin ayrı glikozilasyon profillerini sağlar. Bu yöntem birçok farklı laboratuvarda ^{başarıyla kullanılmıştır 1, 7, 13, 19-31}. Bununla birlikte, MPBH ve Cys-Gly'nin stabilitesi, bu yöntemdeki karmaşık ve uzun süreli prosedür, yöntemin tekrarlanabilirliğini, etkinliğini ve verimliliğini etkilemektedir. Bu yeni protokolde, hem MPBH'yi hem de Cys-Gly'yi çok daha kararlı bir reaktif glutamik asit hidrazid (Glu-hidrazid) ile değiştirdik, bu da yöntemin tekrarlanabilirliğini önemli ölçüde artırdı, tüm prosedürü basitleştirdi ve kısalttı, böylece bir iş günü içinde tamamlanabilir. Bu yeni protokolde, rutin protein glikozilasyon çalışması için normal laboratuvarlar tarafından kolayca benimsenebilecek protokolün ayrıntılı prosedürünü ve tekrarlanabilir ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için gerekli olan teknikleri açıklıyoruz.

Protocol

1. Test için bir antikor Mikroarray yazdırmak

1. 0.5 mg / fosfat tampon salin, ph 7.2 (PBS) içinde ml tüm antikorları ile seyreltilir.
2. 384 kuyucuklu kaynak plakasına alikotu her antikor 40 ul.
3. Scienion sciFLEXARRAYER microarrayer üzerine 384-iyi kaynak plaka yükleyin.
4. Hedef olarak microarrayer üzerine 20 PATH mikroarray slaytlar yükleyin.
5. 27 antikorları ve kontrol proteinler 9x9 modeli (Şekil 1E, 1F) olarak üç nüsha olarak tespit edildiği 48 özdeş Altdizilim, yazdırmak için microarrayer ayarlayın.
6. Antikor mikroarray slaytları yazdırmak için microarrayer başlayın.
7. Antikor mikroarray s....

Discussion

1. Hedef protein ve yakalama antikor seçimi

Antikor mikroarray assay önce belli bir reaktifler ve malzemeler sayılabilir için gerekli ve hazırlanır. Glukanıdır profilleme veya glukanıdır biyomarker tarama, glikoprotein adaylara spesifik antikorların bir panel için bir antikor mikroarray tasarlamak için literatüre veya önceki sonuçlarından göre tespit edilmelidir. Bu antikorlar, genellikle, R & D Systems, vb IgGs gibi farklı satıcılardan satın alınmıştır önceki test bazı IgM ve IgE'nin t.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kimlik	Reaktif Adı	Kısaltma	Şirket	# Kataloğa
L1	Biyotinile Concanavalin A	ConA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L2	Tinile Sambucus Nigra Lektin	SNA	Vektör Laboratuvarları	B-1305
L3	Tinile Lens Culinaris Aglütinin	LCA	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L4	Ricinus Communis Aglütinin Ben biyotinile	RCA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L5	Tinile Aleuria Aurantia Lektin	AAL	Vektör Laboratuvarları	B-1395
L6	Tinile Erythrina Cristagalli Lektin	ECL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L7	Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin II	GSL II	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L8	Tinile buğday tohumu Aglütinin	WGA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L9	Tinile Phaseolus vulgaris Erythroagglutinin	PHA-E	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L10	Tinile Phaseolus vulgaris Leucoagglutinin	PHA-L	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L11	Tinile Fıstık Aglütinin	PNA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L12	Pisum Sativum Aglütinin biyotinile	PSA	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L13	Tinile Dolichos tohumları biflorus Aglütinin	DBA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L14	Tinile Datura stramonium Lektin	DSL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L15	Tinile Sophora Japonica Aglütinin	SJA	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L16	Tinile Soya Aglütinin	SBA	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L17	Tinile Solanum Tuberosum (Patates) Lektin	STL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L18	Tinile Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lektin I	GSL I	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L19	Tinile Vicia villosa Lektin	VVL	Vektör Laboratuvarları	BK-2000
L20	Tinile Lycopersicon esculentum (Domates) Lektin	LEL	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
L21	Tinile Ulex europaeus Aglütinin I	UEA I	Vektör Laboratuvarları	BK-1000
L22	Biyotinile Jacalin	JACALIN	Vektör Laboratuvarları	BK-3000
A1	Keçi F (ab ') 2 Fragment anti-insan IgG, Fc5μ antikoru	IgM	Jackson Immuno Araştırma	109-006-129
A2	Eşek F (ab ') 2 Frag anti-insan IgG (H + L) birtibody	AB1	Jackson Immuno Araştırma	709-006-149
A3	Fare anti-insan IgG F (ab ') 2 monoklonal antikor	AB3	Jackson Immuno Araştırma	209-005-097
A4	Keçi anti-insan alfa 2 makroglobulin poliklonal antikor	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Fare anti-insan alfa-1-antitripsin monoklonal antikor	A1AT	Sigma Aldrich	SAB4200198
A7	Tavşan anti-insan alfa-1-antitripsin poliklonal antikor	ACT	Boyandı	RB-367-A1
A8	Tavşan anti-insanalfa-1-antichymotrypsin poliklonal antikor	ACT	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Fare anti-insan transferin monoklonal antikor	Transferrin	GeneTex	GTX101035
A10	Tavşan anti-insan transferin poliklonal antikor	Transferrin	GeneTex	GTX77130
A11	Keçi anti-insan apolipoprotein J poliklonal antikor	APOJ	Abcam	ab7610
A12	Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor	GP73	Abbott	14H4-23
A13	Fare anti-insan GP73 monoklonal antikor	GP73	SANTA CRUZ BİYOTEKNOLOJİ A.Ş.	sc-101.275
A14	Tavşan anti-insan alfa-1 fetoprotein poliklonal antikor	AFP	GenWay	GWB-41C966
A15	Fare anti-insan alfa-1 fetoprotein monoklonal antikor	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Fare anti-insan hemopexin monoklonal antikor	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Fare anti-insan glypican-3 (1G12) monoklonal antikor	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65.443
A18	Fare anti-insan Kininogen (LMW) monoklonal antikor	Kininogen	Assaypro	20333-05011
A19	Tavşan anti-insan MMP-21 monoklonal antikor	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Fare anti-insan CEACAM-1 monoklonal antikorlarınıny	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Sıçan anti-insan DPPIV/CD26 monoklonal antikor	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Fare anti-insan PIVKA II monoklonal antikor	PIVICA	Kristal chem	8040
A23	Fare anti-karsinoembriyonik antijen	CEA	ABD biyolojik	C1300
A24	Fare anti-CA125 Kanser Antijen	CA125	ABD biyolojik	C0050-01D
A25	Fare anti-CA19-9 Cancer antijeni	CA19-9	ABD biyolojik	C0075-18
A26	Fare anti-Lewis x monoklonal antikor	Lewis X	Calbiochem	434631
bio	Tinile BSA (pozitif kontrol)	Bio	Ev yapımı	N / A

Reaktif s / ekipmanları Adı	Şirket	Katalog numarası
Temassız microarrayer	BioDot A.Ş.	sciFLEXARRAYER
384 mikroplaka	Balıkçı	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrathin nitroselüloz coate mikroarray slaytlar	Gentel	PATH
Slayt Damgalayıcı (isteğe bağlı)	Jel Şirket	WSP60-1
Shaker	Balıkçı	15-453-211
Santrifüj	Eppendorf	5804 000.013
Çıkarılabilir Rack ile Slayt yıkama lavabo / Slayt Boyama Bulaşık	Balıkçı	08-812
Slayt inkübasyon odası / mikroskop lamı kutusu	Balıkçı	03-448-5
Brij 35, su içinde 30 w / v% çözelti	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Balıkçı	P337-100
Sodyum periodat (NaIO 4)	Sigma	311448
L-glutamik asit γ-hidrazit	Sigma	G-7257
Sodyum Asetat Susuz (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Bovine Serum Albumin (BSA)	Lampire Biyolojik Labs	7500804
Fosfat Tampon Salin (PBS) (10X)	Denville Bilimsel	CP4390-48
Dylight 549 konjuge NeutrAvidin	Thermo	22837
Proteaz İnhibitör Kokteyl Tabletler	Roche	4693159001
ChromPure İnsan IgG, Fc parçası	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure İnsan IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure Fare IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure Fare IgG, Fc parçası	Jackson Immunoresearch	015-000-008
Tavşan ChromPure IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure Donkey IgG, tüm molekül	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Mikroarray Tarayıcı	Tecan	LS Reloaded