İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir Toxoplasma Onun konakçı hücre gelen egresses. Protokoller, kimyasal parazitler mutagenize için sağlanan indüklenen çıkış defekti olan mutantlar için zenginleştirmek, ve klonlanmış mutantlar fenotip doğrulamak.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants
Bu makalede
Özet
Özet
Yaygın, zorunlu hücre içi protozoon parazit Toxoplasma gondii immün yetmezlikli hastalarda fırsatçı hastalığa yol açan ve konjenital enfeksiyon üzerine doğum kusurlarına neden olur. 1: litik replikasyon siklusu üç aşama ile karakterize edilir. çekirdekli bir konak hücre aktif invazyonu; 2. konak hücre içine replikasyon; 3. konakçı hücreye aktif çıkış. Acil tahliye mekanizma hala tam olarak moleküler düzeyde anlaşılır bir benzersiz, son derece düzenlenir süreci, giderek takdir ediliyor. Çıkış yatan sinyal yollarının yolları farklı yönlerini 1-5 üzerinde etkili farmakolojik ajanların kullanımı ile karakterize edilmiştir. Gibi çıkış birkaç bağımsız tetikler hücre içi Ca 2 sürümü üzerinde birleşmemiz tespit edilmiştir +, konak hücre işgali 6-8 için de kritik olan bir sinyal. Bu anlayış tanımladı yol açan bir aday gen yaklaşımı bilgilendirdification bitki, çıkış 9 içerisinde yer alan, kalsiyum bağımlı protein kinaz (CDPK) gibi. Buna ek olarak,, anlayış çıkış birkaç son buluşların (kimyasal) genetik yaklaşımlar kullanılarak 10-12 yapılmıştır. Toxoplasma artan genetik erişilebilirlik ile farmakolojik bilgi zenginliği birleştirmek için biz son konak hücrenin çıkış 13 bir kusur ile parazit mutantlar için zenginleşmesine izin veren bir ekran kuruldu. Rutin fenotipleri 16 haline 11,14,15 Toxoplasma biyolojisi çalışmada, yıllar boyunca kullanılan N-etil-N-nitrozoüre (TRK) veya etil metansülfonat (EMS) kullanılarak kimyasal mutajenez olmakla birlikte, sadece son yatan mutasyonlar genetik mapping of -18. Ayrıca, ısıya duyarlı mutantlar, gerekli süreçler disseke edilebilir ve altta yatan genleri doğrudan tespit. Bu mutantlar müsamahakar sıcaklığı (35 ° C) altında vahşi türü olarak davranır, ancak p başarısızbir sonucu olarak, söz konusu mutasyonu, kısıtlayıcı sıcaklığında (40 ° C) roliferate. Burada mutantlarının ısıya duyarlı bir çıkış fenotip 13 ile izole etmek için yeni bir fenotipik bir tarama yöntemi göstermektedir. Meydan çıkış ekranlar için yeniden işgali ve parazitlerin konak hücreleri için genel yapışkanlık hızlı karmaşık,-egressed olmayan parazitler, egressed ayrılması için. Daha önce kurulmuş bir çıkış ekran, ekstrasellüler parazitler 11 intrasellüler ayırmak için adımları biyotinilasyon hantal bir serisi dayanmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda zayıf fenotipleri sonuçlanan koşullu mutantlar oluşturmak vermedi. Burada açıklanan yöntem,, parazitleri 19 konak hücre yapışmasını engelleyen glukanıdır bir rakip, dekstran sülfat (DS) de dahil olmak üzere parazitler egressing güçlü bağlılıklarının üstesinden gelir. Ayrıca, ekstraselüler parazitleri özellikle hücre içi parazit bırakır, pirolidin ditiyokarbamatın (PDTC), tarafından öldürüldü20 sağ salim. Bu nedenle, özellikle, indüklenen çıkış hatalarına parazit mutantlar izole etmek için yeni bir fenotipik ekran, genetik güç artık tamamen konak hücre çıkış yatan moleküler mekanizmalar çözülmeye dağıtmış olabilir.
Protokol
Genel bakış
Protocols, ilk, parazitler% 70 (1 protokolü) öldürme mutagen dozaj tanımlamak için verilmiştir. Sonraki prosedürü bir mutagenized parazit havuzu (protokol 2, Şekil 2), indüklenen çıkış mutantlar zenginleştirmek için sağlanır. Bu, insidansı çıkış mutantların zenginleştirilmiş havuzda test etmek için, ya da, bireysel mutantlarındaki çıkış fenotip (protokol 3) doğrulamak için bir protokol ile takip edilmektedir. Sonuç olarak, bir protokol zenginleştirilen popülasyonlarının tek sınırlayıcı seyreltme (protokol 4) tarafından parazit klonlar oluşturmak üzere temin edilir.
1. Mutajen ve titrasyonu
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Açıklanan protokol bir çıkış defekt ile Toxoplasma mutantlar izole etmek için etkili bir yöntem sağlar. Biz çıkış yolu, bir çift işgali fenotip 13 bazıları çeşitli adımlar boyunca başarıyla mutantlar izole. Işgali üzerine potansiyel etkileri diferansiyel antikor boyama 23,24 ile parazit olmayan işgal istila birbirinden ayırmış sözde kırmızı-yeşil testi kullanılarak tespit edilebilir. Hem işgali ve çıkış testleri için bu, parazitler 13,22 sitoplazmada bir autofluorescent pr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Biz ifşa şey var.
Teşekkürler
Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Scientist Kalkınma Hibe 0635480N ve Sağlık araştırmaları hibe AI081220 Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından finanse edildi. BIC Tapınak Şövalyeleri Göz Vakfı araştırma bursu ile desteklenmektedir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Reaktif Adı | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
| TRK | Sigma-Aldrich | N3385 | -20 ° C'de deposunda DMSO, 1 M Stok |
| EMS | Sigma-Aldrich | M0880 | -20 ° C'de deposunda DMSO, 1 M Stok |
| Dekstran Sülfat | Sigma-Aldrich | D4911 | |
| PDTC | Sigma-Aldrich | P8765 | PBS içinde 100 mM Stok |
| Ocak Şubat Mart Nisan Mayıs Haziran Temmuz Ağustos Eylül Ekim Kasım Aralık Hızlı | Merck Kimyasallar | 65044-93 | |
| Filtre tutucu | Cole-Parmer | 540100 | |
| 3 mikron polikarbonat filtre | WhatmanSchleicher & Schuell | 110612 | |
| Hemositometre | Hausser Bilimsel | 1475 | |
| 2 inkübatör CO | Çeşitli üreticiler, | Nemlendirilmiş, 35, 37 ve 40% 5 CO2 ° C | |
| Flöresanlı mikroskop | Çeşitli üreticiler, | İdeal 63x veya 100x petrol hedefi ile ters, geniş alan |
HBSSc (Black ve ark 11'e göre):
- 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solüsyonu (Hyclone katalog numarası SH30588)
- 100 ul 1M MgCl2 (100 mM sonu)
- 100 ml 1 M CaCI2 (100 mM sonu)
- 2.0 mL 1M Hepes, pH 7.3 (20 mM sonu)
- 84 mg NaHCO 3 (10 mM sonu)
Kaynaklar
- Carruthers, V. B., Moreno, S. N., Sibley, L. D. Ethanol and acetaldehyde elevate intracellular [Ca2+] and stimulate microneme discharge in Toxoplasma gondii. Biochem. J. 342 (Pt 2), 379-386 (1999).
- Moudy, R., Manning, T. J., Beckers, C. J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
