Isolate A Genetik Ekran Toxoplasma gondii Host-hücre çıkış Mutants

Özet

İleri genetik, moleküler düzeyde nasıl aydınlatmak için güçlü bir yöntemdir Toxoplasma Onun konakçı hücre gelen egresses. Protokoller, kimyasal parazitler mutagenize için sağlanan indüklenen çıkış defekti olan mutantlar için zenginleştirmek, ve klonlanmış mutantlar fenotip doğrulamak.

Özet

Yaygın, zorunlu hücre içi protozoon parazit Toxoplasma gondii immün yetmezlikli hastalarda fırsatçı hastalığa yol açan ve konjenital enfeksiyon üzerine doğum kusurlarına neden olur. 1: litik replikasyon siklusu üç aşama ile karakterize edilir. çekirdekli bir konak hücre aktif invazyonu; 2. konak hücre içine replikasyon; 3. konakçı hücreye aktif çıkış. Acil tahliye mekanizma hala tam olarak moleküler düzeyde anlaşılır bir benzersiz, son derece düzenlenir süreci, giderek takdir ediliyor. Çıkış yatan sinyal yollarının yolları farklı yönlerini ^1-5 üzerinde etkili farmakolojik ajanların kullanımı ile karakterize edilmiştir. Gibi çıkış birkaç bağımsız tetikler hücre içi Ca ² sürümü üzerinde birleşmemiz tespit edilmiştir ^+, konak hücre işgali ^6-8 için de kritik olan bir sinyal. Bu anlayış tanımladı yol açan bir aday gen yaklaşımı bilgilendirdification bitki, çıkış ⁹ içerisinde yer alan, kalsiyum bağımlı protein kinaz (CDPK) gibi. Buna ek olarak,, anlayış çıkış birkaç son buluşların (kimyasal) genetik yaklaşımlar kullanılarak ^10-12 yapılmıştır. Toxoplasma artan genetik erişilebilirlik ile farmakolojik bilgi zenginliği birleştirmek için biz son konak hücrenin çıkış ¹³ bir kusur ile parazit mutantlar için zenginleşmesine izin veren bir ekran kuruldu. Rutin fenotipleri ¹⁶ haline ^11,14,15 Toxoplasma biyolojisi çalışmada, yıllar boyunca kullanılan N-etil-N-nitrozoüre (TRK) veya etil metansülfonat (EMS) kullanılarak kimyasal mutajenez olmakla birlikte, sadece son yatan mutasyonlar genetik mapping of ^-18. Ayrıca, ısıya duyarlı mutantlar, gerekli süreçler disseke edilebilir ve altta yatan genleri doğrudan tespit. Bu mutantlar müsamahakar sıcaklığı (35 ° C) altında vahşi türü olarak davranır, ancak p başarısızbir sonucu olarak, söz konusu mutasyonu, kısıtlayıcı sıcaklığında (40 ° C) roliferate. Burada mutantlarının ısıya duyarlı bir çıkış fenotip ¹³ ile izole etmek için yeni bir fenotipik bir tarama yöntemi göstermektedir. Meydan çıkış ekranlar için yeniden işgali ve parazitlerin konak hücreleri için genel yapışkanlık hızlı karmaşık,-egressed olmayan parazitler, egressed ayrılması için. Daha önce kurulmuş bir çıkış ekran, ekstrasellüler parazitler ¹¹ intrasellüler ayırmak için adımları biyotinilasyon hantal bir serisi dayanmaktadır. Bu yöntem aynı zamanda zayıf fenotipleri sonuçlanan koşullu mutantlar oluşturmak vermedi. Burada açıklanan yöntem,, parazitleri ¹⁹ konak hücre yapışmasını engelleyen glukanıdır bir rakip, dekstran sülfat (DS) de dahil olmak üzere parazitler egressing güçlü bağlılıklarının üstesinden gelir. Ayrıca, ekstraselüler parazitleri özellikle hücre içi parazit bırakır, pirolidin ditiyokarbamatın (PDTC), tarafından öldürüldü²⁰ sağ salim. Bu nedenle, özellikle, indüklenen çıkış hatalarına parazit mutantlar izole etmek için yeni bir fenotipik ekran, genetik güç artık tamamen konak hücre çıkış yatan moleküler mekanizmalar çözülmeye dağıtmış olabilir.

Protokol

Genel bakış

Protocols, ilk, parazitler% 70 (1 protokolü) öldürme mutagen dozaj tanımlamak için verilmiştir. Sonraki prosedürü bir mutagenized parazit havuzu (protokol 2, Şekil 2), indüklenen çıkış mutantlar zenginleştirmek için sağlanır. Bu, insidansı çıkış mutantların zenginleştirilmiş havuzda test etmek için, ya da, bireysel mutantlarındaki çıkış fenotip (protokol 3) doğrulamak için bir protokol ile takip edilmektedir. Sonuç olarak, bir protokol zenginleştirilen popülasyonlarının tek sınırlayıcı seyreltme (protokol 4) tarafından parazit klonlar oluşturmak üzere temin edilir.

1. Mutajen ve titrasyonu

Yüksek mutajenik bileşikleri ve sıvılar ile çalışırken özel dikkat, çift eldiven gibi kullanın. Sıvı atıkların uygun şekilde bertaraf edilmesi için ayrı ayrı toplayın.

1. T25 birleştirilebilmeli insan sünnet derisi fibroblast, taze eridi tachyzoites 1 ml (HFF) hücreleri doku kültürü şişeleri inoküle ve 37 saat 18-25 büyümeye °; C,% 5 _CO2 altında, orta Ed1 (% 1 ısı ile inaktive edilmiş fetal bovin serumu, 0.2 mM L-glutamin, 50 U / ml penisilin, 50 ug / ml streptomisin, 0.25 ug / ml Amphotericin B, D-MEM ile desteklenmiş ). Bakınız Roos et al. HFF hücreler ve parazitler ²¹ genel büyüme ve medya için.
2. 10 dk için 10 ml% 0.1 fetal bovin serum (D-MEM içerisinde seyreltik Ed1 01:10), orta ve (burada 37 ° C inkübatöründe "olarak da _{adlandırılır),%} 5 CO2 altında nemli 37 ° C inkübatöründe bırakmak orta yerine .
3. (, Mutagen çalışma dilüsyonları 5 2.5 1.25, sırasıyla, 10 mM), şişeyi başına 0, 12.5, 25, 50, veya 100 ul'lik ENU (DMSO içinde 1 M stok) veya EMS (DMSO içinde 1 M stok) ekleyin. Her balona 100 ul DMSO ekleyin. 4 saat için 37 ° C inkübatöründe inkübe.
4. 10 saniye süreyle, oda sıcaklığında 10 ml soğuk PBS (4 ° C'de ön-soğutuldu) ile tek tabakalı durulama ile üç kez yıkanır.
5. 5 ml PBS ekleyin, gevşek kauçuk polis (hücre scr ile tek tabaka kazıyınaper), fibroblast (ağır makas, iğne maruz iğne dışında mili off klibi) parazit fiziksel kaldırmak için 26.5 G iğne ile kazınmış hücrelerin geçmek, 3.0 um polikarbonat filtre ve filtre. Birden fazla iğne pasajlar konak hücre parazit bırakmadan verimliliği artacaktır.
6. Parazit konsantrasyonu hemasitometre kullanarak güvenin. Parazitlerin sayma öncesi hemocytomer 5 dakika dinlendiriniz.
7. 3 ml başına 10,000 Ed1 parazitler (10 ml 33.333 parazitler için gerekli olan) parazitler seyreltilir.
8. 3 ml, seyreltilmiş parazitler (içeren 10.000 parazitler) içinde bir 6 kuyulu plakanın ile tek bir sıra inoküle. Seri HFF iyi ilk 300 ul aktararak 2.7 ml Ed1 içeren hücreleri ile 6-kuyu plaka konfluent 3 kuyu içinde 10 kat parazitler sulandırmak. 7 gün boyunca 37 ° C inkübatör rahatsız plakaları bırakın.
9. 15 dak 3 ml / iyi% 100 etanol düzeltmek, leke, orta aspire3 ml / kuyucuk kristal viyole çözeltisi (500 ml% 1 amonyum oksalat ile karıştırılarak 125 ml etanol içinde 12.5 g kristal menekşe) 15 dakika boyunca, 3 ml / durulama ve PBS (dakikada 1) ve hava kuru. Oda sıcaklığında.
10. Plaklar sayın ve mutajen konsantrasyonu maruz parazitler (% 70 öldürme dozajı: bkz. Şekil 1)% 30 sağkalım elde etmek için gerekli seçin. % 70 öldürme dozu tarihsel olarak ¹⁴ kullanılır ve daha az genom başına 100 nokta mutasyonları (Farrell, Marth, Gubbels ve ark., El yazması gönderilmektedir) ikna edildi.

2. Çıkış mutantlar zenginleştirilmesi (Şekil 2)

1. Öldürme indüklenmesi% 70 oranında bir mutagen dozaj kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi mutajenez gerçekleştirir. Bir geçişi için yeni bir konakçı hücreler balonuna mutagenized nüfus Grow.
2. Bir mutagenized nüfusu 120.000 taze lizlendi parazitler 10 ml Ed1, T25, HFF konfluent doku kültürü şişesi bulaştırmak. % 5 CO altında 2 saat süreyle 35 ° C inkübatöründe inkübe2 ve nemlenince (buradan sonra "35 ° C inkübatöründe" olarak adlandırılır).
3. , Orta ve 10 saniye daha sonra, 10 ml soğuk PBS ile durulama ve 10 ml Ed1, orta 25 mg / ml dekstran sülfat (DS), ¹³ ile takviye eklemek aspire edin. % 5 _CO2 ve nemlenince (buradan sonra 40 ° C inkübatöründe "adı verilen) altında 26 saat süreyle 40 ° C inkübatöründe inkübe.
4. Çıkış zenginleştiricilerin çalışma çözeltisi hazırlayın. 25 mg / ml DS ile desteklenmiş 10 ml HBSSc içeren 15 ml Falcon tüp çalışma konsantrasyonu az tercih çıkış indükleyici sulandırınız. Pre-dilüsyonları sıcak 30 dakika süreyle 37 ° C'de su banyosunda. Çalışma konsantrasyonları için Tablo 1'e bakınız.
5. Aspire parazit enfeksiyonlu şişeler orta ve önceden ısıtılmış bir çıkış indükleyicisidir çözümü ekleyin. Tablo 1 'de gösterilen kez, 37 ° C inkübatöründe inkübe.
6. Orta aspire edin ve 10 ml soğuk PBS ile 10 saniye yıkayın ve daha sonra 10 ml Ed1 25 mg / ml DS ve 50 mM pirolidin ditiyokarbamatın ile desteklenmiş (PDTC ekleyin: reklam100 mM PDTC PBS içinde Stok d 5 ul) ^13. 5 saat 35 ° C'de inkübatöründe inkübe.
7. , Orta aspire edin ve 10 ml PBS (oda sıcaklığı) ile bir kez, 10 saniye daha sonra durulama ile 10 ml Ed1, orta eklemek. Günlük erlenlere: Çok parazitleri, monolayer yok kadar 35 ° C inkübatör geri mataralar koyun. Bu kurtarma 7 gün sürer.

3. Çıkış analizleri ile mutant fenotipleri Geçerliliği

, Zenginleştirme ekran ve HFF hücrelerinde bir geçiş için zenginleştirilmiş nüfus büyüyor sonra, fenotipleri bir çıkış testi ^11,13 teyit etmeniz gerekecek. Bu testte de protokolü 4 sonra tek klonları doğrulamak için kullanılmalıdır.

1. Lamelleri (ortalama 1 ml Ed1 orta) yetiştirilen konfluent HFF hücreleri içeren bir 24 plaka başına 20.000 parazitler içine inoküle. Aktarmak için bir 40 ° C inkübatöründe 24 saat ve sonra 8 saat 35 ° C'de inkübatöründe inkübe.
2. 1 ml / PBS (1 ile yıkayıpOda sıcaklığında, 0 saniye). 1 ml çıkış indükleyicilerin (sadece negatif kontrol içerir DMSO), pre-ılıtıldı ve HBSSc içinde seyreltilmiş ve Tablo 1 'de tarif edilen kez için inkübe.
3. , Orta aspire edin ve 1 ml / 15 dk için oda sıcaklığında% 100 metanol ile düzeltmek.
4. Mutajenez bir autofluorescent protein ifade ebeveyn parazitler için kullanılmış olsaydı, # 3.5 ¹³ adıma geçin. Olmayan floresan proteini ifade parazitler ebeveyn hattı olarak kullanılmış olsaydı, Diff-Quick az 1 oda sıcaklığında ¹¹ dakika boyunca leke ile sabit lamelleri leke.
5. , Oda sıcaklığında 24-kuyulu plakanın 5 dakika içerisinde, 1 ml / kuyucuk PBS ile yıkanır.
6. Floresan proteini ifade parazitler için: hızlı durulama lamel, GKD ₂ O (daldırma) ve floresan sinyal korumak için gelmount altında kızaklar üzerinde monte. Diff-Quick lekeli parazitler için,% 100 etanol içinde 10 saniye yıkayın ve slayt üzerinde monte etmeden önce hava kurumasını bekleyin.
7. (Floresan) mikroskop kullanma40-60x objektif vakuoller yüzdesi, vakuol karşı (bkz. Şekil 4) intrasellüler kaldı egressed saymak.

4. Seyreltme sınırlayıcı çıkış mutantlar Clone

Fenotip 3 protokol kullanılarak zenginleştirilmiş çıkış mutant nüfus doğrulama sonra, poliklonal nüfus klonlanmış tek parazittir klonlar elde etmek için gereken.

1. , Bir hemositometre parazit nüfus sayımı ve orta Ed1 mililitrede 500 parazitlerin konsantrasyonu ye tamamlanır.
2. Konfluent monolayer HFF hücreleri içeren bir 384-plaka, 40 ul / iyi Ed1 çok kanallı pipetlemeyin kullanarak orta orta değiştirin. Pipetlemeyin 40 ul / kuyucuk kuyulara C3-C12, mutant 2 C13-C22 kuyulara, H3-H12 kuyulara içine mutant 3, mutant içine seyreltilmiş mutant 1, Şekil 5 'de gösterildiği gibi, dört poliklonal popülasyonlarının aşağıdaki gibi plaka başına klonlanmış edilebilir: H13-H22 kuyu içine 4 (kuyularda sonu hacmi 80 ul). Sol bir multi-kanal pipeti, pipet kullanarakution yukarı ve aşağı 5 kere, daha sonra başlayan satırı aşağıdaki satır (sıra C, D veya satır H I) 40 ul aktarmak. Bu, 2-kat seri seyreltiler, satır G (1 ve 2 mutantlarının) veya N satır (mutantlarının 3 ve 4) aracılığıyla devam edin. Son satır fazladan 40 ul atın. Plaka bozmadan 7-10 gün boyunca 35 ° C inkübatör inkübe edin.
3. Görünür, monolayer 'delik' olarak tek bir plak varlığı için bir 10-20x objektif, ters bir mikroskop kuyu kontrol edin.
4. Tek bir plak, mutant başına 4 kuyu Pick ve HFF hücreleri ile doku kültürü şişesi konfluent parazitleri aktarmak ve Ed1 orta dolu. 35 ° C inkübatör parazitler büyüyünce;, ekstrasellüler parazit dağıtmak için günlük şişeler salla. Bu genellikle 7 gün sürer.

5. Temsilcisi Sonuçlar

Mutajenler TRK ve EMS uzun süreler boyunca depolanan sabit değil. Bu nedenle,, mutajenik güç testhisse senetleri tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için kritik önem taşımaktadır. Tipik titrasyon TRK ve hem de EMS eğrileri öldürme sonuçlarını ve Şekil 1 'de gösterilmektedir. Ancak, bu, mutagenez deney için uygun dozu kullanılmış olduğunu tespit etmek için her türlü plak testleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir. Mutagenized parazit nüfus çeşitliliği korumak için, mümkün olduğunca çabuk çıkış mutant ekran ile devam etmek önemlidir. Tipik olarak, yeni bir balona parazitlerin bir geçit kalan parazitler ekran ile ileri gitmeden önce kurtarmak için yapılır. Bunu yaparken, mutantlar bölümü neden olacağını akılda tutulmalıdır. Bu nedenle tüm prosedürü tamamladıktan sonra izole edilen birden fazla klonal mutantların aynı genotip içerdiğini göz ardı edilemez. Fenotipleri (örneğin diferansiyel çıkış indükleyici hassasiyetleri) olmadıkça, onu, mutagenez başına tek bir çıkış mutant izole edilmesi tavsiye edilir aynı mutant birden çok kez izole önlemek içinbirbirlerine çok farklı olabilir. Diğer taraftan,, fenotip arzu edilen mutantların izolasyonu içinde, her bir ekranın sonuçlanır. Özelde, ^{Ca-2 +} iyonofor A23187 dirençli fenotip, nadir ve tek bir çıkış mutant izole etmek için çoklu mutajenez deneyler ve ekranlarını gerektirir. Bu nedenle paralel olarak 5-10 mutagenez ve ekran deneyleri gerçekleştirmek için tavsiye edilir.

Zenginleştirme güç ekranın farklı oranlarda yaban-tip parazitler karıştırma ile, bilinen bir çıkış mutant ile test edilmiştir. Bu karışımları ekranında tabi tutuldu ve, zenginleştirilmiş popülasyonda mutant fenotip sıklığı ölçüldü. Sitoplazmik YFP ifade wild-tip, sitoplazmik RFP ifade parazitler ve bir mutant hattı kullanarak insidansı ¹³ flow sitometri (Şekil 3) tarafından hızlı bir şekilde kurulabilir. Sonuçları mutant fenotipleri rutin 10.000 wild-tip p başına 1 mutant parazit çıkış ile başlayan 80% saflıkta zenginleştirilmiş olabilirarasites ^13. Ancak, ne zaman çıkış mutant: wild-tip parazit başlama oranı, 1:100,000 parazitler ise, izole nüfusun sadece% 1-2 (1:100) çıkış mutantlar. Bu nedenle ekranın zenginleştirme gücü 1.000 kat. Ekranı tipik olarak% 70 geçerli olan 120.000 parazitler, aşılama ile başlayan bu yana, biz genellikle iki tur zenginleştirme gerçekleştirmek. Izole parazit zenginleştirme tur arasında büyüdü. Bu prosedür, yaban-tip parazitler 1:1,000,000 çıkış mutant ile başlayarak zaman dahi% 100 mutant nüfusu yol açar.

, Fenotipleri doğrulamak ve karakterize etmek için çıkış testi bireysel vakuol farklılaşmasını sağlayan konak hücre enfeksiyon çokluğu gerektirir. Bireysel parazitlerin etrafa dağılmış olarak yüksek oranda çıkış koşulları analiz ederken bu özellikle önemlidir. Şekil 4 'de gösterildiği gibi, egressed popülasyonlarının ayrılmış değilse yüzdesi düşük kolaydırbir vakuol olarak iki egressed vakuol sayma tarafından çıkış. Çıkış ve işgali ile ilgili süreçleri ve bazı ısıya duyarlı fenotipleri düşük sıcaklıkta hafif bir fenotip gösterilecek yana değil, tüm mutantlar benzer işgali verimliliği olacaktır. Böyle mutantlar nedenle kendi çıkış fenotip doğru bir değerlendirme için yeterince yüksek bir bir vakuol yoğunluğu elde etmek için birkaç kat daha yüksek dozlarda inoküle gerekir. Ayrıca, bazı çıkış indükleyicileri verimli dört veya daha az parazit içeren vakuoller çıkış teşvik etmemektedir. Bunun gibi, zaman çıkış assay başlangıç ​​Vakuollerin sekiz ya da daha fazla parazitler içeren çok önemlidir. Laboratuarımızda biz ekran mutantlar, diğer çıkış arttırıcılar karşı belirli bir çıkış zenginleştirici ile izole. Kendi çapraz reaktivite profilleme mutantların farklı sınıflarda toplanabilir. Son olarak, tüm çıkış mutantlar ısıya duyarlı olacaktır. , Çıkış indükleyicileri intracellula yayımlanmasından önce adımları tetikleme ile izole özellikle mutantlarr Ca ^{2 +} olmayan ısıya duyarlı fenotipleri yatkındır. Bu sinyal, hücre içi Ca ^{2 +} sürümü yakınsar önce çıkış yol açabilir paralel yollara kaynaklanmaktadır.

Şekil 1. Kimyasal mutajen doz titrasyonu. A. Plak Testler çeşitli EMS konsantrasyonları ve çeşitli sayıda da belirtilmektedir başına parazit kullanarak 6-kuyu plaka yapılan. Beyaz noktalar parazit plaklar içinde HFF mono tabakasında oluşturulmuş B, Çeşitli dozajlar için EMS (B) ve TRK (C) maruz bağlı parazitlerin C. sağkalım eğrileri. Survival plak analizleri ile değerlendirildi. % 70 öldürme uyararak doz mutagenez deneyleri için seçilir. , Üç bağımsız deneyin ortalamasını + / - standart sapma gösterilmiştir.

Şekil 2. Zaman ilerlemesi x-ekseni tarafından temsil edilir ise çıkış mutant zenginleştirme ekranın şematik gösterimi. Sıcaklık, y ekseni üzerinde gösterilir. Yeşil parazitler kırmızı parazit wild-tip parazitler yansıtmaktadır çıkış mutant parazitler, yansıtmaktadır. Zamanlama çıkış indükleyici koşulları ve stimülasyon değişiklikleri üst kısmında gösterilir ve, sıcaklık profili yansıtan mavi çizgi üzerinde oklarla işaretlenmiştir. Benimsenen Eidell ve ark. ¹³

Şekil 3. Tipik çıkış mutant fenotipleri zenginleştirme çeşitli oranlarda (x-ekseni) wild-tip parazitler karıştırılarak bir çıkış mutant zenginleştirilmesi sonuçları. Ekrandan sonra büyümüş nüfus çıkış mutant fenotipleri yüzdesi y ekseni çizilir ve akım sitometri (çıkış mutant parazitlerin sitoplazmik YFP ifade ile değerlendirildi, wild-tip parazitler cy ifade) RFP toplasmic. Üç bağımsız deney sonuçları, kırmızı, mavi ve yeşil veri noktaları ile temsil edilmektedir. Benimsenen Eidell ve ark. ¹³

Şekil 4. Tipik bir çıkış testinin sonuçları. . Oklar 4-8 parazit içeren dört farklı bozulmamış vakuol işaretleyin. B. Oklar dört bağımsız egressed vakuol yansıtan dağınık parazitlerin dört gruba işaretleyin. A23187 (B) veya DMSO ile çıkış (A) bir negatif kontrol olarak indüklenen. Parazitler sitoplazmik YFP ²² ifade.

Şekil 5, , Klonal parazit çizgiler. Dört poliklonal popülasyonları (kırmızı, mavi, sarı, yeşil) için seri seyreltme, seri HFF hücreleri ile tek bir 384-plaka confluent seyreltilir. Satır C ve başına 10 parazitleri almak veseyreltilmiş (40 ul + 40 ul) sırasıyla H ve N, satırlar kadar 2-kat. Gri tonunu iyi başına parazitlerin azalan sayısını gösterir. Tipik olarak, tek bir klonlar, DF ve JL satırlar bulunmuştur.

Bileşik	Hisse senedi	Çalışma konsantrasyonu	T25 (10 ml) için ihtiyaç duyulan ul	İnkübasyon süresi (dk)
DTT	DMSO içinde 1 M	5 mM	50	15
etanol	190 Proof	% 5	500	30
A23187	DMSO içinde 2 mM	1 uM	5	5
nigericin *	DMSO içinde 2 mM	10 uM	50	30

* Nigericin zenginleştirmek kullanılamazparazitler olarak Ment ekran nigericin stimülasyon hayatta değil; sadece çıkış mutantların doğrulama nigericin kullanın.

Tablo 1 işlemlerde kullanılan çıkış indükleyicileri. 25 mg / ml ekran veya mutant doğrulama (çıkış testi) için hiçbir DS DS içeren 10 ml HBBSc sulandırınız. Tüm bileşikler, Sigma-Aldrich.

Tartışma

Açıklanan protokol bir çıkış defekt ile Toxoplasma mutantlar izole etmek için etkili bir yöntem sağlar. Biz çıkış yolu, bir çift işgali fenotip ¹³ bazıları çeşitli adımlar boyunca başarıyla mutantlar izole. Işgali üzerine potansiyel etkileri diferansiyel antikor boyama ^23,24 ile parazit olmayan işgal istila birbirinden ayırmış sözde kırmızı-yeşil testi kullanılarak tespit edilebilir. Hem işgali ve çıkış testleri için bu, parazitler ^13,22 sitoplazmada bir autofluorescent pr...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Reaktif Adı	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
TRK	Sigma-Aldrich	N3385	-20 ° C'de deposunda DMSO, 1 M Stok
EMS	Sigma-Aldrich	M0880	-20 ° C'de deposunda DMSO, 1 M Stok
Dekstran Sülfat	Sigma-Aldrich	D4911
PDTC	Sigma-Aldrich	P8765	PBS içinde 100 mM Stok
Ocak Şubat Mart Nisan Mayıs Haziran Temmuz Ağustos Eylül Ekim Kasım Aralık Hızlı	Merck Kimyasallar	65044-93
Filtre tutucu	Cole-Parmer	540100
3 mikron polikarbonat filtre	WhatmanSchleicher & Schuell	110612
Hemositometre	Hausser Bilimsel	1475
2 inkübatör CO	Çeşitli üreticiler,		Nemlendirilmiş, 35, 37 ve 40% 5 CO2 ° C
Flöresanlı mikroskop	Çeşitli üreticiler,		İdeal 63x veya 100x petrol hedefi ile ters, geniş alan

HBSSc (Black ve ark ^11'e göre):

• 98.0 ml Hanks Balanced Salt Solüsyonu (Hyclone katalog numarası SH30588)
• 100 ul 1M _MgCl2 (100 mM sonu)
• 100 ml 1 M _CaCI2 (100 mM sonu)
• 2.0 mL 1M Hepes, pH 7.3 (20 mM sonu)
• 84 mg NaHCO ₃ (10 mM sonu)