Yöntem makalesi

Kolesterol akışı Testi

DOI:

10.3791/3810

⸱

6 Mart 2012

 ,  , 
1Baker IDI Heart and Diabetes Institute

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolesterol tahlilini kültürü hücrelerinden kolesterol akışı hızı ve hücreler serbest kolesterol kabul plazma alıcısının kapasitesi ölçmek için tasarlanmıştır. Tahlil içi havuzu ve ekstrasellüler alıcı için kolesterol serbest bırakılması arasında kolesterol kolesterol, denge ile hücrelerin etiketlenmesi oluşur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücrelerin kolesterol içeriği hücre zarının bozulması, apoptoz ve nekroz 1 bir hücreye sonuçları çok fazla veya çok az kolesterol, çok dar sınırlar içinde tutulmalıdır. Hücreler hücre içi sentezi ve plazma lipoprotein kaynak kolesterol, hem de kaynakları tamamen kolesterol için hücrelerin ihtiyaçlarını karşılamak için yeterli olabilir. Kolesterol sentezi ve alım süreçleri sıkı regüle ve kolesterol eksikliği azdır 2 olarak uygulanır. Aşırı kolesterol daha yaygın sorun 3'tür. Hepatositlerin dışında ve bir dereceye adrenokortikal hücrelere, hücreler kolesterol düşmesine edemiyoruz. Hücreler kendi kolesterol miktarını azaltmak için iki seçeneğiniz var: aynı zamanda toksik kolesterol esterleri ile hücrelerin aşırı olarak kolesterol esterleri, sınırlı kapasiteli bir seçenek haline dönüştürmek kolesterol ve kolesterol akışı, potansiyel olarak sınırsız kapasiteye sahip bir seçenek. Kolesterol akışı bir specBöyle ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı proteinler A1 (ABCA1) ve G1 (ABCG1) ve çöpçü reseptör tip B1 gibi hücre içi nakliyeciler, bir dizi ile düzenlenmiştir IFIC süreci. Plazma kolesterol doğal alıcı yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) ve apolipoprotein AI olduğunu.

Kolesterol akışı assay kültürü hücrelerinden kolesterol akışı oranı ölçmek için tasarlanmıştır. Bu kolesterol akışı ve / veya hücre serbest kolesterol kabul plazma alıcıları kapasitesini korumak için hücre kapasitesi ölçer. Deneyi aşağıdaki adımlardan oluşur. Adım 1: serum içeren orta etiketli kolesterol ekleme ve 24-48 saat hücreleri ile kuluçkaya hücresel kolesterol etiketleme. Bu adımda kolesterol hücrelerinin yüklenmesi ile kombine edilebilir. Adım 2: bütün hücre içi kolesterol havuzlarına etiketli kolesterol dengelenmeye serum içermeyen aracı madde içinde hücrelerinin inkübasyon. Bu aşamada hücresel kanal aktivasyonu ile kombine edilebilirolesterol taşımacıları. Adım 3: ekstraselüler alıcı ve hücreler arası alıcı için etiketli kolesterol hareketinin kantitatif sahip hücrelerin inkübasyon. Kolesterol öncüleri yeni sentezlenen kolesterol etiketlemek için kullanılması durumunda, bir dördüncü aşama, kolesterol saflaştırma, gerekli olabilir.

Deneyi aşağıdaki bilgi sağlar: (i) belirli bir işlem (a mutasyonu, bir itici, aşağı, bir aşırı ekspresyonu ya da tedavi) efflux kolesterol hücre kapasitesi etkiler ve (ii) nasıl plazma alıcısının kapasitesi kolesterol kabul nasıl Bir hastalık veya bir tedavi tarafından etkilenir. Bu yöntem, çoğu zaman kardiyovasküler araştırmalar, metabolik ve nörodejeneratif hastalıklar, bulaşıcı hastalıklar ve üreme bağlamında kullanılır.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. [3H]-kolesterol hazırlanması

  1. Çeker ocak içinde bir 1.5 ml mikrofuj tüp (0,5 oyuk başına μCi (19 kBq) Tipik bir deney için gerekli olan) içine [3 H] kolesterol gerekli miktarda dağıtın.
  2. [3H]-Kolesterol tolüen içinde süspansiyon haline getirildiği takdirde, 1 μCi bir son konsantrasyon% 100 etanol ile N2 gaz ve Pastör pipetiyle (de 37 kBq / ul. Vorteks ve karışım ile tamamen aşağı kurutun.

2. Kaplama Hücreler ve Etiketleme Hücresel kolesterol

Insan monosit 4,5, THP-1 insan monosit-makrofajlar 6,7,8, RAW 264.7 murin makrofajlar 5,9,10,11, HeLa hücrelerinde 12, endotel insan umbilikal ven: Bu protokol, aşağıdaki hücre tipleri kullanılarak test edilmiştir trombositler hücreleri (HUVEC), BHK-21 hücreleri 9, insan ve fare fibroblastlar 13,14, HepG2 hücrelerinde insan hepatokarsinoma 15 ve modifiye formunda, <> 16 sup.

  1. Hücreleri yeniden süspanse edin ve onları saymak. 0.9 ml tam medyum içinde oyuk başına 6 0.2x10 hücre nihai yoğunlukta 12 oyuklu plakalar haline plakası hücreleri. Hücreler büyümeye devam edecek ve efflux deney zaman iyi başına 0.8x10 6 hücre ulaşacak. Gibi farklılaştırılmış THP-1 hücreleri gibi bölmek değil hücreler için, ekim yoğunluğu başına iyi 0.8x10 6 hücre olmalıdır. Sırasıyla veya 24 de plaka, çift ya da başına hücre sayısının yarısından - 6 kullanıyorsanız. Kuyu sayısı her deneysel koşul için dört nüsha tayini için yeterli olmalıdır.
  2. THP-1 hücrelerinin farklılaşmasını gerekli ise, 48-72 saat boyunca ortam PMA (nihai konsantrasyon 0.1 ug / ml) ilave edilir.
  3. [3H] kolesterol içeren mikrofüj tüpe ortam küçük bir alikotu ekleyin.
  4. Tam kültür ortamı ayrı bir alikotu (100 ul / kuyucuk) içine [3H] kolesterol eklemeden önce ortamı ile iki tüpün yıkanır.
  5. hücreleri (çukur başına son hacim 1 ml) ile kuyucuklara [3 H] kolesterol içeren ortam ekleyin. Hücrelerinde hiçbir tedavi etiketlenmesi önce gerekli ise, hücreler [3 H] kolesterol içeren orta kaplama olabilir.
  6. (37 ° C'de,% 5 CO2) hücre kültürü inkübatöre 48 saat boyunca inkübe hücreleri.

3. Denge Kuluçka

  1. 48 saat inkübasyondan sonra, mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Sağlıklı oldukları ve yaklaşık% 80 izdiham olduğundan emin olun.
  2. Ortam [3 H] kolesterol içeren çıkarın. PBS ile hafifçe hücreleri yıkayın. 3 yıkama kez tekrarlayın.
  3. Serumsuz ortam hazırlayın. Serum serbest-medya; Gerekirse, LXR agonist (örneğin 1-4 mMol / L 'TO-901317 gibi) veya cAMP (sadece fare kökenli hücreler için 0.3 mmol / L) ekleyerek hücrelerini aktive eder.
  4. Her kuyuya 500 mikrolitre serum serbest Medya ekle.
  5. (37 ° C'de,% 5 CO2) hücre kültürü inkübatöre 18 saat boyunca inkübe edilir.

4. Kolesterol akışı Kuluçka

  1. Serum içermeyen aracı madde içinde 18 saatlik inkübasyondan sonra, mikroskop altında hücreleri kontrol. (En az% 80 konfluense) sağlıklı ve birleşik olduğundan emin olun.
  2. Serum içermeyen aracı madde içinde kolesterol akışı alıcısının çözeltisi hazırlayın. Muhatapları örnekler:
    Apolipoprotein AI (apoA-I) (son konsantrasyonu 10 mg / ml)
    Yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) (son konsantrasyonu 20 mg / ml)
    Siklodekstrin (nihai konsantrasyon 200 ug / ml)
    Plazma (son konsantrasyon% 1-2)
  3. PBS ile hafifçe hücreleri yıkayın.
  4. Her bir kuyuya muhatapları ile serumsuz medya 250 ul ekleyin.
  5. Arka plan efflux (NO alıcı ile serum serbest medya efflux) belirlemek için kuyu bir takım bırakın
  6. Hücre kültürü inkübatörde 2 saat boyunca hücreleri (37 ° C'de,% 5 CO2) inkübe. Gerekirse efflux inkübasyon süresi 30 dakika ile 8 saat değişebilir.

5.. İşleme Samples

  1. 2 saat sonra kuluçka mikroskop altında hücrelerin kontrol edin.
  2. 1.5 ml mikrofuge'de tüpler içine medya toplayın. Hücresel enkaz kaldırmak için oda sıcaklığında 1-10 dakika 14.000 rpm'de Spin.
  3. 7 ml sintilasyon şişeye 100 ul medya aktarın. 5 Insta-jel Plus mls (Perkin Elmer) ve vorteks karışımı ekleyin. 4 ° C'de geri kalan örnekleri depolamak
  4. 30 dakika için dondurucuya plakaları yerleştirin. Her kuyucuğa 500 ul dH 2 O ekleyin. Tüm hücreleri kuyu dibinden kaldırdı emin olmak için mikroskop altında hücrelerin kontrol edin. Hala yapışık ise, 4 ° C de bir gece veya sıyrık kuyularında dH 2 O ile plakalar bırakın ya.
  5. Tüm hücreler kaldırdı sonra, hücre kümeleri kırmak için aşağı ve yukarı Pipeti. 7 ml sintilasyon vial içine 100 ul aktarın. 5 Insta-jel Plus mls (Perkin Elmer) ve vorteks karışımı ekleyin. 4 ° C'de geri kalan plakaları depolamak
  6. Sintilasyon sayacı sintilasyon şişelerine yerleştirin. [3 H] için saymak için sayaç yapılandırındpm birimleri.

6. Sonuçları analiz

  1. Kolesterol akışı oranı, genellikle kolesterol bir oranda hücrelerinden alıcı taşınır olarak ifade edilir. Aşağıdaki formül kullanılır:

figure-protocol-1

  1. Belirli bir akış alıcı (boşluk) varlığında veya yokluğunda, akış arasındaki fark olarak hesaplanır.

figure-protocol-2

7. Timeline

figure-protocol-3

8. Temsilcisi Sonuçlar

Bir kolesterol akışı deneyde bir sonucu bir örneği, Şek. 1. Bu deneyde THP-1 insan monosit oldu farklı kabul eden makrofaj ve kolesterol akışı içine ayırtlanmıştırtest edilmiştir. Hiçbir alıcıları ("boş") ile orta kolesterol akışı% 0.79 idi ve bu değer bir non-spesifik akış olarak kabul edilmiş ve diğer değerleri çıkarıldı. İnsan ApoA-I (nihai konsantrasyon 30 ug / ml) ile kolesterol akışı% 4.75 olmuştur. Bir başvuru plazma örneği arası deneysel değişkenlik izlemek için, bu deney dahil edildi. Bir referans örnek deney boyunca çok sayıda veri normalizasyon için kullanılır, ama değişkenliği yüksek olup olmadığını test tekrar bu ihtiyatlı bulunabilir. Hastanın ilacı ile muamele edilmiş, önce ve sonra bir hasta plazma (son konsantrasyon% 2) test edilmiştir. Bu hastada ilaç kolesterol akışı desteklemek için plazma kapasitesi üzerinde olumsuz etkilere sahip olduğu sonucuna varılmıştır.

Efflux deneyde bir sonucu başka bir örneği şekil gösterilmektedir. 2. Bu deneyde RAW 264.7 makrofaj LXR agonisti TO-901.317 ile birlikte bir gece inkübasyon (son konsantrasyon ile aktive veya devreye alınmadı1 mmol / L) ve insan plazma aynı örnek (% 2) kolesterol akışı test edildi. Bu LXR agonisti ile ABC taşıyıcıları hücresel ifade aktivasyon ekstrasellüler alıcı için kolesterol serbest hücrelerinin kapasitesini artırır sonucuna varılmıştır.

figure-protocol-4
Şekil 1.. Çeşitli alıcıları için THP-1 hücrelerinden kolesterol akışı. Kolesterol akışı yüzdesi (yani etiketli kolesterol oranı hücrelerinden belirtilen alıcı taşındı) boş değerler çıkarma sonra gösterilmiştir. Ortalama ± dörderli tayin SD, * p <0.05.

figure-protocol-5
Şekil 2. Kolesterol akışı RAW 264.7 insan plazma LXR agonisti ile aktif ya da aktif değil. Yüzde (yani etiketli kolesterol oranı ile kolesterol akışı hücrelerden taşındıbelirtilen alıcı) boş değerler çıkarma sonra gösterilmiştir. Ortalama ± dörderli tayin SD, * p <0.001.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kolesterol akışı ölçmek için açıklanan yönteme hücreleri bir hücre dışı kolesterol alıcı için kolesterol hareketinin ölçülmesi için tasarlanmıştır. Bu metodoloji anlamada çok önemli hususlar vardır.

Etiketleme ve alışım

Tarif metodolojide etiketli kolesterol serumu içeren serum ilave edilir. Ayrıntılı olarak incelenmiştir asla rağmen, kolesterol serum lipoprotein içine dahil edilmiştir ve hücreleri tarafından alınmasını kabul edilir. Bu lipoproteinler için yeterli z...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar bu çalışma ile ilgili hiçbir çatışan çıkarları beyan ederim.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Victoria Hükümeti'nin OIS Programı tarafından Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (526.615 ve 545.906) gelen ve kısmen hibe ile desteklenmiştir. DS NHMRC bir üyesidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler \ Hücreleri HeLa THP-1 RAW HUVEC BHK-21 HFF
Komple Medya RPMI
-% 10 FCS
-% 1 L-glütamin
-% 0,2 Kalem strep 		M199
-% 5 FCS
-% 1 L-glütamin
-% 1 Pen Strep
-% 2 HEPES (1M)
-% 7 endotel hücre büyümesi takviyesi (EKG) 		DMEM
-% 10 FCS
-% 1 L-glütamin
-% 0,2 Kalem strep
Serum Ücretsiz Media RPMI
-% 1 L-glütamin
-% 0,2 Kalem strep 		M199
-% 1 L-glütamin
-% 1 Pen Strep
-% 2 HEPES (1M)
-% 7 endotel hücre büyümesinith takviyesi (EKG) 		DMEM
-% 1 L-glütamin
-% 0,2 Kalem strep
Passage Yöntemi 1 x Tripsin Süspansiyon Kazımak 1 x Tripsin
Passage Oranı 03:10 01:03 01:20 01:03 01:03
Hücre Etkinleştirme (opsiyonel) TO-901.317
- LXR-agonist
- Final kons. 4 uM
Diğer Reaktifler forbol miristat-12 13-asetat (PMA)
- Hücre farklılaşması
- Final kons. 0.1μg/ml

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
  2. Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
  3. Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
  4. Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
  5. Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
  6. Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
  7. Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
  8. Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
  9. D'Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
  10. Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
  11. Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
  12. Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).
  13. Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
  14. Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
  15. Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
  16. Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cholesterol EffluxCellular CholesterolABCA1 TransporterABCG1 TransporterHigh Density LipoproteinApolipoprotein A ICholesterol LabellingSerum Free IncubationAcceptor QuantitationCholesterol Purification

İlgili makaleler