Kolesterol tahlilini kültürü hücrelerinden kolesterol akışı hızı ve hücreler serbest kolesterol kabul plazma alıcısının kapasitesi ölçmek için tasarlanmıştır. Tahlil içi havuzu ve ekstrasellüler alıcı için kolesterol serbest bırakılması arasında kolesterol kolesterol, denge ile hücrelerin etiketlenmesi oluşur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Hücrelerin kolesterol içeriği hücre zarının bozulması, apoptoz ve nekroz 1 bir hücreye sonuçları çok fazla veya çok az kolesterol, çok dar sınırlar içinde tutulmalıdır. Hücreler hücre içi sentezi ve plazma lipoprotein kaynak kolesterol, hem de kaynakları tamamen kolesterol için hücrelerin ihtiyaçlarını karşılamak için yeterli olabilir. Kolesterol sentezi ve alım süreçleri sıkı regüle ve kolesterol eksikliği azdır 2 olarak uygulanır. Aşırı kolesterol daha yaygın sorun 3'tür. Hepatositlerin dışında ve bir dereceye adrenokortikal hücrelere, hücreler kolesterol düşmesine edemiyoruz. Hücreler kendi kolesterol miktarını azaltmak için iki seçeneğiniz var: aynı zamanda toksik kolesterol esterleri ile hücrelerin aşırı olarak kolesterol esterleri, sınırlı kapasiteli bir seçenek haline dönüştürmek kolesterol ve kolesterol akışı, potansiyel olarak sınırsız kapasiteye sahip bir seçenek. Kolesterol akışı bir specBöyle ATP bağlayıcı kaset taşıyıcı proteinler A1 (ABCA1) ve G1 (ABCG1) ve çöpçü reseptör tip B1 gibi hücre içi nakliyeciler, bir dizi ile düzenlenmiştir IFIC süreci. Plazma kolesterol doğal alıcı yüksek dansiteli lipoprotein (HDL) ve apolipoprotein AI olduğunu.
Kolesterol akışı assay kültürü hücrelerinden kolesterol akışı oranı ölçmek için tasarlanmıştır. Bu kolesterol akışı ve / veya hücre serbest kolesterol kabul plazma alıcıları kapasitesini korumak için hücre kapasitesi ölçer. Deneyi aşağıdaki adımlardan oluşur. Adım 1: serum içeren orta etiketli kolesterol ekleme ve 24-48 saat hücreleri ile kuluçkaya hücresel kolesterol etiketleme. Bu adımda kolesterol hücrelerinin yüklenmesi ile kombine edilebilir. Adım 2: bütün hücre içi kolesterol havuzlarına etiketli kolesterol dengelenmeye serum içermeyen aracı madde içinde hücrelerinin inkübasyon. Bu aşamada hücresel kanal aktivasyonu ile kombine edilebilirolesterol taşımacıları. Adım 3: ekstraselüler alıcı ve hücreler arası alıcı için etiketli kolesterol hareketinin kantitatif sahip hücrelerin inkübasyon. Kolesterol öncüleri yeni sentezlenen kolesterol etiketlemek için kullanılması durumunda, bir dördüncü aşama, kolesterol saflaştırma, gerekli olabilir.
Deneyi aşağıdaki bilgi sağlar: (i) belirli bir işlem (a mutasyonu, bir itici, aşağı, bir aşırı ekspresyonu ya da tedavi) efflux kolesterol hücre kapasitesi etkiler ve (ii) nasıl plazma alıcısının kapasitesi kolesterol kabul nasıl Bir hastalık veya bir tedavi tarafından etkilenir. Bu yöntem, çoğu zaman kardiyovasküler araştırmalar, metabolik ve nörodejeneratif hastalıklar, bulaşıcı hastalıklar ve üreme bağlamında kullanılır.
Protokol
1. [3H]-kolesterol hazırlanması
- Çeker ocak içinde bir 1.5 ml mikrofuj tüp (0,5 oyuk başına μCi (19 kBq) Tipik bir deney için gerekli olan) içine [3 H] kolesterol gerekli miktarda dağıtın.
- [3H]-Kolesterol tolüen içinde süspansiyon haline getirildiği takdirde, 1 μCi bir son konsantrasyon% 100 etanol ile N2 gaz ve Pastör pipetiyle (de 37 kBq / ul. Vorteks ve karışım ile tamamen aşağı kurutun.
2. Kaplama Hücreler ve Etiketleme Hücresel kolesterol
Insan monosit 4,5, THP-1 insan monosit-makrofajlar 6,7,8, RAW 264.7 murin makrofajlar
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Kolesterol akışı ölçmek için açıklanan yönteme hücreleri bir hücre dışı kolesterol alıcı için kolesterol hareketinin ölçülmesi için tasarlanmıştır. Bu metodoloji anlamada çok önemli hususlar vardır.
Etiketleme ve alışım
Tarif metodolojide etiketli kolesterol serumu içeren serum ilave edilir. Ayrıntılı olarak incelenmiştir asla rağmen, kolesterol serum lipoprotein içine dahil edilmiştir ve hücreleri tarafından alınmasını kabul edilir. Bu lipoproteinler için yeterli z.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar bu çalışma ile ilgili hiçbir çatışan çıkarları beyan ederim.
Teşekkürler
Bu çalışma Victoria Hükümeti'nin OIS Programı tarafından Ulusal Sağlık ve Avustralya Tıbbi Araştırma Konseyi (NHMRC) (526.615 ve 545.906) gelen ve kısmen hibe ile desteklenmiştir. DS NHMRC bir üyesidir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Reaktifler \ Hücreleri | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Komple Medya | RPMI -% 10 FCS -% 1 L-glütamin -% 0,2 Kalem strep | M199 -% 5 FCS -% 1 L-glütamin -% 1 Pen Strep -% 2 HEPES (1M) -% 7 endotel hücre büyümesi takviyesi (EKG) | DMEM -% 10 FCS -% 1 L-glütamin -% 0,2 Kalem strep | |||
| Serum Ücretsiz Media | RPMI -% 1 L-glütamin -% 0,2 Kalem strep | M199 -% 1 L-glütamin -% 1 Pen Strep -% 2 HEPES (1M) -% 7 endotel hücre büyümesinith takviyesi (EKG) | DMEM -% 1 L-glütamin -% 0,2 Kalem strep | |||
| Passage Yöntemi | 1 x Tripsin | Süspansiyon | Kazımak | 1 x Tripsin | ||
| Passage Oranı | 03:10 | 01:03 | 01:20 | 01:03 | 01:03 | |
| Hücre Etkinleştirme (opsiyonel) | TO-901.317 - LXR-agonist - Final kons. 4 uM | |||||
| Diğer Reaktifler | forbol miristat-12 13-asetat (PMA) - Hücre farklılaşması - Final kons. 0.1μg/ml | |||||
Kaynaklar
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
