$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Adım 1: Fare Embriyonik Kök (MES) Hücre Kültürü (Zamanlama: 3 gün)
1. Kaplama birincil fare embriyonik fibroblast (PMEF)
- PMEF yapışması için jelatin ile kaplayın dört adet 100 mm doku kültürü yemekleri. Her bir çanak% 0.1 jelatin çözeltisi (StemCell Technologies) 8 ml ilave edilir ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
- Yemeklerinden jelatin fazla çıkarın. Bulaşıkları durulama yapmayın.
- Yaklaşık içeren Mitomisin C-inaktive PMEF (Millipore) bir şişe sulandırınız. 5 x 10 6 PMEF ortam 40 ml içine hücreleri (Tablo 1 'de tarif bakınız) ve dört adet 100 mm'lik doku kültürü plakası üzerine tabaklar. PMEF MES hücreleri için bir besleyici tabakası oluşturmak.
- PMEF MES hücre kültürleri eklemeden önce en az bir gün kaplama edilmelidir. PMEF kaplama sonra 1 hafta kadar kullanılabilir.
2. Kaplama MES Hücreleri
Motor nöronların içine MES hücre farklılaşmasının etkinliğini izlemekBiz HBG3, motor nöron özel yükseltici HB9 kontrolü altında eksprese EGFP bir transjenik fare elde edilen bir ES hücre hattı kullanılır.
- Defrost 37 ° C su banyosunda HBG3 MES hücrelerin 1 flakon (yaklaşık 1 x 10 7, Dr Douglas Kerr, Johns Hopkins Üniversitesi tarafından katkı). 15 ml tüp ES medya (Tablo 1 tarife bakınız) 5 ml ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 rpm'de hücreleri aşağı spin.
- 10 ng / ml 'lik nihai bir konsantrasyon taze olarak eklendi Lösemi inhibe edici faktör (LİF) ile ES ortam 20 ml süpernatan aspirat ve Pastör pipetiyle MES hücreleri. NOT: LİF kullanım gününde ilave edilmesi ve farklılaşmadan durumda MES hücreleri korumak için gereklidir.
- Her yemekte PMEF 10 ml PMEF ortamı çıkarın ve her yemek için HBG3 ES hücre süspansiyonu 10 ml ekleyin.
- 24 saat sonra kaplama, MES hücre boyutu Şekil 1B ok ile gösterilen koloni benzer küçük koloniler oluştururlar. Kaplama sonrası 72 saat, koloniboyutu es artış, çok sayıda çapı yaklaşık 100 mikron (Şekil 1B, oklarla gösterilen) olmak. Bu hücrelerin farklılaşması için hazırız. Ortam hücrelerinin proliferasyon korumak için günlük değiştirilmesi gerekir.
2. Adım 2: Sinir İndüksiyon (Zamanlama: 2 gün)
Motor nöron içinde MES hücrelerinin farklılaşmasını teşvik etmek için, MES hücreleri PMEF ayrılmış ve bir süspansiyon bir ortamda yetiştirilir gerekir. Jelatin kaplı şişeler MES hücrelerinden PMEF ayırmak için kullanılır.
- MES koloniler nöral indüksiyon (farklılaşma gün 0 olarak tanımlanır), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca% 0.1 jelatin (18 ml / şişe) ile kat 2 T150 şişeler için hazır ve ardından aşırı jelatin kaldırmak ve 1x PBS üç kez yıkayın zaman. NOT: Her 100 mm çanak kültür PMEF ayırmak için bir T150-jelatin kaplı şişesi gerekir.
- Dikkatle gevşek bağlı koloniler çıkarmak için değil emin, aspirasyon ortamı çıkarın. 10 ml PBS kısa eklely ve sonra yıkama adımı tamamlamak için aspirasyon kaldırın.
- PMEF gelen MES hücreleri ayırmak için,% 0.25 eklemek tripsin / EDTA (3 ml / çanak, StemCell Teknolojileri) ve 37 'de 3-5 dakika inkübe ° C kök hücre ve PMEF levhadan ayırmak kadar. Koloniler (15-20 kez) kırmak için aşağı LIF ve pipet hücreleri olmadan 15 ml taze ES medya ekleyin ve. Daha sonra, bir% 0.1 jelatin kaplı T150 şişesine ilave ve 37 C'de 30 dakika inkübe ° C. ES hücrelerinin yüzen gerekirken inkübasyondan sonra, PMEF jelatinize yüzey eklemek gerekir. 50 ml'lik bir tüp içine kayar MES hücreler toplanır.
- (Tablo 1 tarife bakınız) Sinir Farklılaşma Orta 10 ml 800 rpm ve Pastör pipetiyle hücreleri aşağı Spin.
- Bir 100 mm bakteriyel ya da süspansiyon kültürü çanağı üzerine bir hemasitometre ve ardından plaka yaklaşık 2 x 10 6 MES hücreleri kullanılarak hücreleri hesaplama. Bu plakalar süspansiyon kültürleri büyüme izin ve embriyoid organları (EBS) oluşumunu arttırabilir.
- Differentia AçıkTION gün 1, MES hücrelerinin ışık mikroskobu altında görülebilen küçük kayan agrega (EBS) oluştururlar. Herhangi bir bulaşma, PMEF çanak eklemek. 3 dk için düşük hızda (500 rpm) 15 ml'lik bir santrifüj tüpüne ve içine süspansiyon hücreleri ve medya transfer edin. Dikkatli medya aspire, yeni bir bakteriyel çanak plaka hücreleri daha sonra pelet EBS taze Sinir Farklılaşma Orta 10 ml ekleyin ve. Ortam ikmal ek olarak, bu adım adım önceden arta taşıyan herhangi bir PMEF kaldırır.
- Farklılaşma Gün 2, EBS motor nöronlar indüklenen hazırdır.
3. Adım 3: Motor Nöron Özelliği (Zamanlama: 5 gün)
- Farklılaşma gün 2, girdap kültürü çanak ve 15 ml tüp içine medya ve EBS aktarmak Açık. EBS ağırlık (~ 10 dakika) ile ya da 3 dk için düşük hızda (500 rpm) santrifüje edilerek dinlendiriniz.
- (Tarifi bkz. Motor Nöron Farklılaşma 10 ml (MSB) orta dikkatli ve Pastör pipetiyle EBS orta aspire
- Çapı 200 mikron ve kuvvetli GFP sinyali (Şekil 1C) ifade olmalıdır - farklılaşma 7. günde, EBS yaklaşık 150 olmalıdır. Bu EBS kaplı yemekleri veya lamelleri poly-DL-ornithine/laminin üzerine disosiye ve kaplama olmaya hazırız.
4. Adım 4: Poly-DL-ornithine/laminin Kaplı lameller hazırlanması (Zamanlama: 2 gün)
İki gün EBS dissociating önce (farklılaşma 5. gününde yani), poly-DL-ornithine/laminin-coated lamelleri hazırlamak.
- 24-iyi plakanın altına yerleştirin 12 mm yuvarlak lamelleri (Warner Araçlar). 10X bir stok çözelti (1 mg / ml) elde etmek için 25 mg 25 ml'de poli-DL-ornitin (Sigma-Aldrich), steril, çift damıtılmış su (d 2 H 2 O) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, konsantrasyonlarda elde etmek için d 2 H 2 O ile poli-DL-ornitin bir 1/10 dilüsyon yapmak100 mcg / ml oranı. Gece boyunca 4 at 24-kuyulu plakalı ve inkübe her bir yanı ° C ila 0.5 ml ilave edilir.
- Ertesi gün (farklılaşma günde 6), aspirat poli-DL-ornitin ve doku kültürü kaputu plakaları ve kuru kapak slipleri hava sağlar. D 2 H2O ile üç kez plakası kuyuları çalkalayın. Bir saat için hava kurumasını bekleyin.
- 100X stok solüsyonu (200 ug / ml) yapmak için buzlu soğuk PBS 1X 5 ml içinde 1 mg fare laminin (Millipore) içinde çözülür. Zaman kullanıma hazır, buzlu-soğuk 1X PBS (2 mcg laminin / ml) 1/100 dilüsyon olun. 0.5 mL / 4 iyi bir 24-iyi plaka ve inkübe ° C gece için. Tohum hücreleri önce, aşırı laminin kaldırılır ve kuyular 1X PBS iki defa durulanmalıdır. Lamelleri MSB'nin ortamı (0.5 ml / oyuk) saklanabilir.
5.. Adım 5: Axon Uzama (Zamanlama: 2 gün)
- Farklılaşma Gün 7 günü, 15 ml tüp içine EBS toplamak ve EBS (yaklaşık 3 dakika) yerleşmesine izin. Aspirat ortam ve yeniden sPBS içinde uspend EBS. EBS yerleşmek ve sonra PBS aspire izin verin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın. Hafifçe karıştırılır ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edilir, EBS üzere Accumax (Millipore) 1 ml ilave edilir. Sonra EBS kapsayan aşırı Accumax aspire.
- EBS ayırmak için, MSB orta 3 ml ekleyin. EBS bozmak için 1 ml Eppendorf mikropipet (mavi uç) kullanarak pipet aşağı yukarı 20 kez. Oda sıcaklığında 2 dakika süreyle inkübe edilir. Tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için hücre süzgecinden kap (BD Falcon) ile 12x75 mm tüp için hücre süspansiyonu aktarın. Tek hücrelerin verim zenginleştirmek şekilde filtre tarafından tutulan kalan topaklar ve hücreler ile ayrışma adımda tekrar edin. Nihai tek bir hücre süspansiyonu 6 ml olacaktır.
- Yavaşça bu tek hücre süspansiyonu karıştırmak ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. 2x10 ml başına 5 bir hücre yoğunluğuna MND ortamı (10, her BDNF ng / ml, GDNF, CNTF ve NT-3 ile desteklenmiş) içine hücreleri ile seyreltilir. Po içeren 24 kuyucuklu plaklar hücre süspansiyonu (0.5 ml / oyuk) ekleyinly-DL-ornithine/laminin kaplamalı lamelleri (yukarıda tarif edildiği gibi, daha önce hazırlanmış). Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün (Şekil 1D) sonra uzun neurites uzatmak.
6. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1A protokolünün bir taslağını göstermektedir. 1. adımda, MES hücreleri PMEF üzerinde yetiştiriliyor ve spontan farklılaşmasını önlemek için LIF ile desteklenmiş. Genel olarak, farklılaşmamış MES koloniler yuvarlak ve kompakt olup, kenarları açıkça tanımlamıştır. Koloniler birbiri ile temas halinde değildir. Tipik olarak, MES hücrelerin her 2 ~ 3 gün 1:04 oranında bölünmüş olmalıdır. Ancak, her bir hücre hattı farklı bir oranda artacak ve split oranı ampirik olarak tespit edilmelidir. Şekil 1B oklar 3 gün için bir PMEF besleyici tabakaya kültürleme sonra MES hücrelerinin tipik görünüşünü göstermektedir. Bu koloniler büyük (çapı 50-100 mikron) ama yine yuvarlak ve tanımlanmış avantajı sağlamaks. Bu aşamada koloniler farklılaşma ya da alt kültür için hazırız. Şekil 1B bir ok ucu, genellikle kaplama 24 saat sonra bulduğu küçük bir MES koloni gösterir. Kaplama dört gün sonra, MES hücreleri büyümüş olur. Onlar ayrım başlıyor belirten düzleştirilmiş bir görünüm ve tanımlanan sınırlar kaybı gösterir. Böyle hücreler, nöronal hücre içine farklılaşma için optimal değildir.
Motor nöronların içine MES hücreleri ayırt etmek için, MES hücreleri EB oluşumuna izin süspansiyon koşullarda yetiştirilen gerekir. Adım 2'de, ES hücreleri EB oluşumunu teşvik etmek için bir besleyici tabakası olmadan bir kültür yüzey üzerine aktarılmaktadır. Bu adımda, bunlar bir sinir soyu için doğrudan hücrelere 2 gün süreyle Noggin, bFGF ve FGF-8 ile desteklenmiş Neural Farklılaştırma besiyerinde enkübe edilir. Küçük EBS farklılaşma 1. günde mikroskop altında görülebilir. Bunlar, orta yüzen edilmelidir. Bulaşma PMEF da gün 1 adresinde bulunabilirdiferansiyasyonun ve çıkarılması gerekir. Bu hücreler EBS yeni bir bakteriyel bir çanakla pasajlanmağa çok zaman ortadan kalkar bakteriyel yemekler uygun. Böylece, farklılaşma günde 2 tarafından, az ya da hiç PMEF kültürü tabağına görülmelidir. 3. adımda, yeni yemekler için EBS transferi kalan PMEF çıkarılmasını sağlamalıdır devam etti. EBS RA ile takviye Motor Nöron Farklılaşma (MSB) medya kültürü ve motor nöronların içine hücreleri ayırt etmek için 5 gün boyunca SAG edilir. Kültür sırasında, EBS boyutları büyümeye devam ediyor ve farklılaşma 3. günde çıplak gözle görülebilir ~ 4. Şekil 1C farklılaşma 7. günde EBS mikroskobik görünüm gösterir. Farklılaşmamış hücrelerin aksine, EBS GFP ekspresyonu nedeniyle güçlü floresans gösterir. Bu EBS optimal farklılaşmış ve ayrışma için hazırız. Akış sitometrisi% 51 ± ayrışmış EBS gelen hücreler% 0.8 'i ifade eden hücrelerin 5 GFP ayrışmıştır olduğunu gösterdi. Adım 5, inci kültürdeGDNF, CNTF, BDNF, ve uzun akson uzantısı projeksiyonlar NT3 sonuçlar varlığında ese motor nöron. Şekil 1B 2 gün ayrışmış EBS'nin sonra kaplama farklılaşmış hücreler görünümünü gösterir. Kaplamalı hücrelerin hücre gövdeleri uzanan uzun neurites not edin. Immünofloresan boyama GFP + hücrelerin pan-nöronal marker (nörofilaman-orta zincirli) ve iki motor nöron spesifik belirteçler, (Islet-1 ve kolin asetiltransferaz, Şekil 2) ifade gösterir.
Şekil 1. Motor nöronları (resim Wu ve ark güncellenmiştir. 5) MES hücrelerin Farklılaşma. MES hücrelerinden motor nöron için farklılaşma protokolünün A) şeması. B) ayrım MES hücreler fibroblast besleyici tabakasının üstünde yuvarlak koloniler oluştururlar. Onlar zayıf GFP var. C) MES hücreleri besleyici ve katmanlar ayrıldı kültürlerdekiEBS oluşturmak için düşük eki yemekler kırmızı. Farklılaştırma prosesi ilk iki gün boyunca, hücreler 50 ng / ml Noggin, 20 ng / ml bFGF ve 20 ng / ml FGF-8 maruz bırakıldı. Daha sonra, onlar 1 uM retinoik asit ve 5 gün süreyle 1 uM sonik kirpi agonisti SAG ile ayırt etmek için oluşturuldu. Farklılaştırılmış MES hücreleri güçlü GFP floresan dile getirdi. D)-7 gün sonra farklılaşma, EBS poly-DL-ornithine/laminin kaplı levhalar üzerine ekildi ve ayrıştırıldı. Farklılaşmış hücre kültüründe 2 gün sonra uzun nöral süreçleri uzatıldı. Ölçek çubuğu = 200 mikron. MN = motor nöron. B, C ve D parlak bir alan görüntüler ve B ', C' ve D 'ilgili floresans görüntülerdir.
Şekil 2,. MES hücresinden türetilmiş motor nöron karakterizasyonu. Nörofilaman orta zincirli (NF-M, kırmızı), ChAT (kırmızı) ve Islet-1 (kırmızı) immünofloresan boyaması GFP (yeşil) ifade tesadüf olduession. DAPI (mavi) çekirdekleri tanımlamak için kullanılmıştır. Ölçek çubuğu = 50 um.