Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) bir reseptör içine ilk sırayla koku ampul içinde ikinci dereceden nöronlara iletilir aksiyon potansiyelleri tetikleyen güncel koku sinyalleri dönüştürmek. Burada aynı anda odorant bağlı reseptör fare ORNs mevcut ve aksiyon potansiyelleri kaydetmek için emme pipet tekniği tarif.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Emme Pipet Tekniği kullanılarak Olfaktör Reseptör Nöronlar Kaydedilmiş odorant bağlı Cevapları
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Hayvanlar burun boşluğunda bulunan kimyasal duyusal sistemleri aracılığıyla çevrelerindeki kokulu ortamda tadabilirsiniz. Kimyasal duyusal sinyaller gibi yiyecek seçimi, yırtıcı, conspecific ve eşini tanıma ve diğer sosyal ilgili ipuçları gibi karmaşık davranışları etkiler. Olfaktör reseptör nöronları (ORNs) olfaktör epitel gömülü nazal kavite dorsal kısmında yer almaktadır. Bunlar bipolar nöronların (bkz. Şek. 1, başlangıçta Genel Fizyoloji Dergisi'nde yayınlanan Reisert & Zhao 1) koku ampul bir akson göndermek ve koku kaplayan mukus içine nereye kirpikler yayar gelen epitelyal sınırına tek bir dendrit uzatmak epitel. Kanal (Şekil 1) - tüyler sonuçta silier transdüksiyonu kanalları, siklik nükleotid-geçiş (CNG) kanal ve bir Ca2 + ile aktive Cl arasından akım akışına neden olmaktadır eksitatör sinyal transdüksiyonu amaçlı içerir. Ensuing depolazasyon hücre gövdesi 2-4 aksiyon potansiyeli oluşturma tetikler.
Bu videoda ORNs gelen odorant bağlı yanıtları kaydetmek için "emme pipet tekniği" kullanımını açıklar. Bu yöntem ilk çubuk fotoreseptör 5 kayıt yapmak geliştirilmiş ve bu yöntem bir varyantı fare koni fotoreseptör 6 kaydetmek için modifiye jove.com bulunabilir. Emme pipet tekniği daha sonra da ORNs 7,8 kayedetmek uyarlanmıştır. Kısaca, koku ve epitel hücre izolasyon ayrışma takiben, ORN, tüm hücre gövdesi bir kayıt pipet ucu içine çekilmektedir. Dendrit ve kirpikler banyo solüsyonu maruz ve örneğin odorant veya farmakolojik engelleyici uygulamayı etkinleştirmek için çözüm değişiklikleri böylece erişilebilir kalır. Bu yapılandırmada, intraselüler çevreye hiçbir erişim elde edilir (hayır tam hücreli gerilim kelepçe) ve hücre içi voltajı değişir serbest kalır. Bu, tümkirpikler ve hücre gövdesi 9 tarafından ateş hızlı aksiyon potansiyelleri de kaynaklanır yavaş reseptör akımı eş zamanlı kayıt OWS. Bu iki sinyal arasında kinetikleri farkı da farklı filtre ayarları kullanılarak ayrılması için olanak sağlar. Bu teknik, her vahşi tip ya da knockout farelerde kullanılabilir veya aynı zamanda ORNs belirli alt etiket GFP ifade ORNs dan seçici olarak kaydetmek için, örneğin, belirli bir odorant reseptör veya iyon kanalı eksprese eden.
Protokol
1. Kayıt Ayarı
Kayıt odasına bir hava masa üzerine takılan ve elektriksel bir Faraday kafesi kullanılarak korumalıdır faz kontrast optik ile Nikon TE2000U Eclipse inverted mikroskop üzerine monte edilir. Pleksiglas kayıt odasına iki bölümden kısmen bir bariyer ile ayrılmış ve bir Silanlanmış cam slayt üzerine yapıştırılmış oluşur. Odasının bir bölümü, diğer odorant için erken yerleşik maruz ancak henüz kullanılmamış hücreleri en aza indirmek için kayıt sırasında uyaran-poz için kullanılan en hücrelere yerleştirmek için kullanılır. Kayıt ayarları bir pelet pipet tutucu ve toprak elektrot monte emme pipet (aşağıya bakınız) oluşmaktadır. Emme ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Emme pipet teknik aynı zamanda bir ORN gelen koku ile endüklenen yavaş reseptör akım ve bifazik hızlı aksiyon potansiyelleri kaydetmek için kullanılan bir elektrofizyolojik yöntemdir. Hücrenin, plazma membranında bozulmaması için, bu yöntem odorant hücre içi tepkileri faktörlerin sitoplazmik iyon konsantrasyonu ya da seyreltme değişikliklere bağlı olarak değiştirilmiş sağlamak yer bozulmamış hücre içi ortamı terk eder. Hücreleri uzun süreler (fare kurbağa ve 1 saat en fazla 4 saat) için kaydı alınabilir. Hücre gövdes.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa etmek başka bir şey var.
Teşekkürler
Bu çalışma NIH DC009613, İnsan Sınır Bilim Programı ve Morley Bakım Bursu (JR) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar | |
|---|---|---|---|---|
| Malzeme Adı | Tip | Şirket | Katalog / Model numarası | Yorumlar |
| Hava tablosu | ekipman | Newport | ||
| Hava Pompası | ekipman | Newport | ACGP | |
| Pipet Çektirme | ekipman | Sutter | P-97 | |
| Borosilikat cam | ekipman | TEFE | 1B150-4 | |
| Nikon Eclipse Ters mikroskop | ekipman | Nikon | TE2000U | Hg lambası, GFP filtresi ve hedefleri 20X ve en az 5X ile donatılmış |
| Amplifikatör PC-501A | ekipman | Warner | 64-0008 | Headstage 1 GΩ |
| Elmas bıçak | Ekipman | Ismarlama | ||
| Sayısallaştırıcı Mikro1401 A / D | ekipman | Cambridge Elektronik Tasarım | ||
| Filtre ünitesi 3382 | ekipman | Krohn Hite kurumlar | ||
| Sinyal | yazılım | Cambridge Elektronik Tasarım | ||
| Ag / AgCl Pelet Molded | ekipman | TEFE | 64-1297 | |
| Pipet tutucu | ekipman | Warner | 64-0997 | Özel uyacak şekilde değiştirilmiş headstage |
| Kayıt odası | Ekipman | Ismarlama | ||
| Mikromanipülatör MP85-1028 | ekipman | Sutter Instrument | Mikromanipülatör MP85-1028 | |
| Madeni yağ | Çözüm | Sigma | 330779-1L | |
| Osiloskop TDS 1001 | ekipman | Tektronix | ||
| Üç namlulu kare cam tüp | Ekipman | Warner | 64-0119 | 5 cm uzunluğunda 0.6 mm ID, |
| Valf | ekipman | Lee Şirketi | ||
| ValveLink 8.2 | ekipman | Bilimsel otomatikleştirin | ||
| SF-77B Perfüzyon hızlı adım | ekipman | Warner |
Kaynaklar
- Reisert, J., Zhao, H. Perspectives on: Information and coding in mammalian sensory physiology: Response kinetics of olfactory receptor neurons and the implications in olfactory coding. J. Gen. Physiol. 138, 303-310 (2011).
- Kaupp, U. B.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
